VisioTracker, un approccio innovativo automatizzato di analisi oculomotoria
Özet
Il VisioTracker è un sistema automatizzato per l'analisi quantitativa di prestazioni visive dei pesci adulti e larve piccole basa sulla registrazione dei movimenti oculari. È dotato di un controllo completo sulle proprietà stimolo visivo e analisi in tempo reale, consentendo di alto-rendimento di ricerca in settori quali lo sviluppo del sistema visivo e la funzione, farmacologia, studi di circuiti neurali e l'integrazione senso-motoria.
Abstract
Indagini per lo sviluppo del sistema visivo e la funzione richiederà quantificabili modelli comportamentali di prestazioni visive che sono facili da suscitare, robusta e semplice da manipolare. Un modello adatto è stato trovato nella risposta optokinetic (OKR), un comportamento riflessivo presente in tutti i vertebrati dovute al valore di selezione elevato. Il OKR consiste in lenti stimolo-seguenti movimenti di occhi alternati a rapidi movimenti saccadici reset. La misurazione di questo comportamento può essere facilmente effettuata in larve di zebrafish, a causa della sua insorgenza precoce e stabile (pienamente sviluppata dopo 96 ore dopo la fecondazione (HPF)), e beneficia della conoscenza approfondita su zebrafish genetica, per decenni uno dei modelli favorita organismi in questo campo. Nel frattempo, l'analisi dei meccanismi simili a pesci adulti ha acquisito importanza, in particolare per le applicazioni farmacologiche e tossicologiche.
Qui descriviamo VisioTracker, completamente automatizzata, ad alta throughput sistema per l'analisi quantitativa delle prestazioni visive. Il sistema è basato su una ricerca svolta nel gruppo del Prof. Stephan Neuhauß ed è stato ri-progettato da sistemi di TSE. Esso consiste in un dispositivo di immobilizzazione per piccoli pesci monitorata da una elevata qualità video camera dotata di un obiettivo ad alta risoluzione zoom. Il contenitore pesce è circondato da uno schermo tamburo, sul quale generate dal computer pattern stimolo può essere proiettata. Movimenti oculari vengono registrati e analizzati automaticamente dal pacchetto software VisioTracker in tempo reale.
L'analisi dei dati consente l'immediato riconoscimento di parametri quali la durata fase di lento e veloce, ciclo di frequenze in movimento, lenta fase di guadagno, l'acuità visiva e la sensibilità al contrasto.
Risultati tipici permettono ad esempio la rapida identificazione di mutanti sistema visivo che non mostrano alcuna alterazione evidente nella morfologia di tipo selvatico, o la determinazione di effetti quantitativi delle farmacologica o tossici e mutageniagenti sulle prestazioni del sistema visivo.
Protocol
Discussion
L'importanza della OKR per lo studio della funzione visiva è stata riconosciuta dalla comunità scientifica per un lungo periodo (Pasqua e Nicola 1996, 1997), e tenta di quantificare realmente il paradigma hanno iniziato oltre un decennio fa. Pasqua e Nicola (1996) ha sviluppato un sistema motorizzato tamburi rotanti a righe, in cui è stato analizzato il video del movimento degli occhi manualmente. Questo sistema ha sofferto la mancanza di immobilizzazione dell'embrione pesce, che ha richiesto l'uso frequente riposizionamento, e in grado di rilevare i movimenti di tracciamento degli occhi solo con grande difficoltà. Un passo in avanti è stato l'uso di un video-proiettata tamburo a strisce per consentire una maggiore variabile presentazione dello stimolo generato dal computer (Roeser & Baier, 2003. Rinner et al, 2005a).
Il prevalentemente manuale, fotogramma per fotogramma analisi delle registrazioni videoregistrate ha dimostrato di essere estremamente laborioso, e in una certa misura ostacolato da osservatore polarizzazione (Beck et al.,2004). Analisi automatizzata in tempo reale è stato suggerito di consentire l'utilizzo di meccanismi comportamentali di apprendimento di feedback (maggiore et al., 2004). L'uso di illuminazione ad infrarossi e stimoli rotanti frequenza controllati è stato sperimentato da Beck et al. (2004). Tuttavia, il sistema descritto non è stato utilizzato solo per le larve, e l'analisi è stata effettuata off-line. Inoltre, il VisioTracker permette il controllo completo stimoli, incluso cambiare lo stimolo durante l'esperimento, consentendo una maggiore flessibilità e spontanea influenza sul corso dell'esperimento. Inoltre, la creazione stimolo digitale utilizzato dal VisioTracker superato i problemi menzionati in precedenza con accelerazione della massa inerte di un tamburo stimolo strisce (Beck et al., 2004).
Le larve di ritenuta da metilcellulosa non interferisce in modo significativo con il movimento degli occhi e non ha effetti a lungo termine sugli zebrafish benessere. Larve di pesci sono stati con successomantenuto incorporato in metilcellulosa per diversi giorni, fino ossigeno attraverso la pelle diventa insufficiente per la domanda con l'aumentare dell'età (Qian et al., 2005).
I pesci adulti metodo di contenimento è altrettanto facile sull'animale. La breve durata dell'esperimento, accoppiata con la possibilità di scambiare rapidamente l'animale prova per una diversa, aumenta ulteriormente gli aspetti positivi benessere degli animali del sistema. Poiché le branchie sono continuamente lavata con acqua, è conveniente spike l'acqua con qualsiasi prodotto chimico di scelta per studiare l'effetto sui movimenti oculari e prestazioni visive. Analogamente un wash-out esperimento può essere aggiunto senza la necessità di gestire l'animale tra gli esperimenti.
Rumore pixel nell'immagine video è stato ridotto al minimo lisciando algoritmi del software VisioTracker proprietario, consentendo misurazioni estremamente precise di posizione degli occhi e la velocità angolare. Inoltre, per facilitare la statistical'analisi, il software filtra i movimenti saccadici che si verificano a velocità fissa e non contribuiscono alla comunicazione sperimentale. Una media di curve di velocità più di 7 fotogrammi video facilitato analisi successive.
Il VisioTracker apre una nuova dimensione per molte aree di ricerca diverse. Il sistema ei suoi predecessori sono già stati utilizzati con successo per quantificare la performance visiva in larve di zebrafish, utilizzando parametri come l'acuità visiva, sensibilità al contrasto e adattamento alla luce (Rinner et al., 2005a, Schönthaler et al., 2010), di analisi funzionale del fotorecettori cono dopo la manipolazione dei membri della cascata di trasduzione visivo (ad esempio, Rinner et al, 2005b, Renninger et al, 2011..), o l'analisi dei difetti visivi in larve di zebrafish mutanti (ad esempio Schönthaler et al, 2005, 2008;. Bahadori et al., 2006). L'interdipendenza di maturazione morfologica e funzionale del sistema visivoè stato studiato da misurazioni okr per dimostrare che l'acuità visiva è principalmente ma non completamente limitata dalla spaziatura fotorecettore stadi larvali (Haug et al., 2010).
Il VisioTracker è ugualmente adatto per analizzare la funzione visiva in zebrafish adulti e altre specie di pesci di dimensioni simili (Mueller e Neuhauß (2010), la presente relazione).
È anche concepibile utilizzare il sistema in aree di ricerca come tossicologia o farmacologia quale sostanze da esaminare possono essere aggiunti al flusso dell'acqua che circonda le branchie dei pesci adulti. Inoltre, la versatilità di VisioTracker consente analisi più approfondite, ad esempio di ontogenetics della funzione visiva, la funzione del circuito neurale e lo sviluppo, o sensomotoria di controllo (vedere recensione è in Huang & Neuhauß, 2008).
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
KPM è stato supportato da EU FP7 (RETICIRC).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0387 |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (MS-222) | Sigma-Aldrich | E10521 |
| 35 mm cell culture dish | Corning | 430165 |
| Serum pipette | Greiner bio-one | 612 361 |
| VisioTracker | TSE Systems | 302060 |
Referanslar
- Bahadori, R., Rinner, O., Schonthaler, H. B., Biehlmaier, O., Makhankov, Y. V., Paris, R., Jagadeeswaran, P., Neuhauss, S. C. F. The fade out mutant is a novel genetic model for Hermansky-Pudlak syndrome. Investigative Optical and Visual Sciences. 47, 4523-4531 (2006).
- Beck, J. C., Gilland, E., Baker, R., Tank, D. W. Instrumentation for measuring oculomotor performance and plasticity in larval organisms. Methods in Cell Biol. 76, 383-411 (2004).
- Brand, M. G. M., Nüsslein-Vollhard, C., Nüsslein-Vollhard, C., Dahm, R. Keeping and raising Zebrafish. Zebrafish, Practical Approach Series. , 7-37 (2002).
- Easter, S. S., Nicola, G. N. The development of vision in the zebrafish (Danio rerio). Dev. Biol. 180, 646-663 (1996).
- Easter, S. S., Nicola, G. N. The development of eye movements in the zebrafish (Danio rerio). Dev. Psychobiol. 31, 267-276 (1997).
- Haug, M. F., Biehlmaier, O., Mueller, K. P., Neuhauss, S. C. F. Visual acuity in zebrafish: behavior and histology. Frontiers in Zoology. 7, 8-8 (2010).
- Huang, Y., Neuhauss, S. C. F. The optokinetic response in zebrafish and its applications. Frontiers in Bioscience. 13, 1899-1916 (2008).
- Major, G., Baker, R., Aksaya, E., Mensh, B., Seung, H. S., Tank, D. W. Plasticity and tuning by visual feedback of the stability of a neural integrator. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 101, 7739-7744 (2004).
- Mueller, K. P., Neuhauss, S. C. F. Quantitative Measurements of the optokinetic response in adult fish. J. Neurosci. Meth. 186, 29-34 (2010).
- Neuhauss, S. C. F., Biehlmaier, O., Seeliger, M. W., Das, T., Kohler, K., Harris, W. A., Baier, H. Genetic disorders of vision revealed by a behavioral screen of 400 essential loci in zebrafish. J. Neurosci. 19, 8603-8615 (1999).
- Qian, H., Zhu, Y., Ramsey, D. J., Chappell, R. L., Dowling, J. E., Ripps, H. Directional asymmetries in the optokinetic response of larval zebrafish. Zebrafish. 2, 189-196 (2005).
- Renninger, S. L., Gesemann, M., Neuhauss, S. C. F. Cone arrestin confers cone vision of high temporal resolution in zebrafish larvae. Eur. J. Neurosci. 33, 658-667 (2011).
- Rick, J. M., Horschke, I., Neuhauss, S. C. F. Optokinetic behavior is reversed in achiasmatic mutant zebrafish larvae. Curr. Biol. 10, 595-598 (2000).
- Rinner, O., Rick, J. M., Neuhauss, S. C. F. Contrast sensitivity, spatial and temporal tuning of the larval zebrafish optokinetic response. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 46, 137-142 .
- Rinner, O., Makhankov, Y. V., Biehlmaier, O. S., Neuhauss, C. F. Knockdown of cone specific kinase GRK7 in larval zebrafish leads to impaired cone-response recovery and delayed dark adaptation. Neuron. 47, 231-242 (2005).
- Roeser, T., Baier, H. Visuomotor behaviors in larval zebrafish after GFP-guided laser ablation of the optic tectum. J. Neurosci. 23, 3726-3734 (2003).
- Schonthaler, H., Fleisch, V. C., Biehlmaier, O., Makhankov, Y. M., Rinner, O., Bahadori, R., Schwarz, H., Neuhauss, S. C. F., Dahm, R. The zebrafish mutant leberkn del/vam6 resembles human multi-systemic disorders caused by aberrant trafficking of endosomal vesicles. Development. 135, 387-399 (2008).
- Schonthaler, H. B., Franz-Odendaal, T. A., Hodel, C., Gehring, I., Schwarz, H., Neuhauss, S. C. F., Dahm, R. The zebrafish mutant bumper shows a hyperproliferation of lens epithelial cells and fibre cell degeneration leading to functional blindness. Mech. Dev. 127, 203-219 (2010).
- Schonthaler, H. B., Lampert, J. M., Lintig, J. v. o. n., Schwarz, H., Geisler, R., Neuhauss, S. C. F. A mutation in the pmel17 gene leads to defects in melanosome biogenesis and alterations the visual system in the zebrafish mutant fading vision. Gelişim Biyolojisi. 284, 231-242 (2005).
