VisioTracker, eine innovative automatisierte Ansatz zur oculomotorius Analysis
Özet
Die VisioTracker ist ein automatisiertes System für die quantitative Analyse der visuellen Leistung von Larven und kleine erwachsene Fische auf der Aufzeichnung von Augenbewegungen basieren. Es verfügt über die vollständige Kontrolle über visuelle Reiz Eigenschaften und Echtzeit-Analyse und ermöglicht High-Throughput-Forschung in Bereichen wie visuelle System Entwicklung und Funktion, Pharmakologie, neuronalen Schaltkreis Studien und sensomotorische Integration.
Abstract
Untersuchungen des visuellen Systems Entwicklung und Funktion erforderlich quantifizierbare Verhaltensmodelle der Sehleistung, die einfach zu entlocken, robust und einfach zu handhaben sind. Ein geeignetes Modell ist in der optokinetischen Antwort (OKR), eine reflexive Verhalten in allen Wirbeltieren aufgrund seiner hohen Selektionsdruck Wert gefunden. Der OKR beinhaltet langsame Reiz-folgenden Bewegungen der Augen mit schnellen Zurücksetzen Sakkaden abwechselten. Die Messung dieses Verhalten wird leicht aus im Zebrafisch-Larven durchgeführt, aufgrund seiner frühen und stabiles Einsetzen (vollständig nach 96 Stunden nach der Befruchtung (HPF) entwickelt), und dem die als umfassendes Wissen über Zebrafisch Genetik, seit Jahrzehnten eine der bevorzugten Modell Organismen in diesem Bereich. Inzwischen ist die Analyse von ähnlichen Mechanismen bei erwachsenen Fisch hat an Bedeutung gewonnen, insbesondere für pharmakologische und toxikologische Anwendungen.
Hier beschreiben wir VisioTracker, ein vollautomatisches High-throughput-System zur quantitativen Analyse der Sehleistung. Das System basiert auf der Forschung in der Arbeitsgruppe von Prof. Stephan Neuhauss durchgeführt und wurde von TSE Systems neu gestaltet. Es besteht aus einer Immobilisierungsvorrichtung für kleine Fische durch eine hochwertige Videokamera mit einem hochauflösenden Zoomobjektiv ausgestattet überwacht. Der Fisch wird von einem Behälter Siebtrommel umgeben, auf dem Computer-generierten Reizmuster projiziert werden kann. Augenbewegungen aufgezeichnet und automatisch durch den VisioTracker Software in Echtzeit analysiert.
Datenanalyse ermöglicht die sofortige Erkennung von Parametern wie langsame und schnelle Phasen-Dauer, Bewegung Taktfrequenz, langsame Phase Verstärkung, Sehschärfe und Kontrastempfindlichkeit.
Typische Ergebnisse ermöglichen zum Beispiel die schnelle Identifizierung von visuellen Systems Mutanten, die keine erkennbare Veränderung in Wildtyp-Morphologie zeigen, oder die Bestimmung der quantitativen Auswirkungen der pharmakologischen oder toxischen und mutagenenAgenten auf visuelle System-Performance.
Protocol
Discussion
Die Bedeutung des OKR für das Studium der visuellen Funktion hat in der wissenschaftlichen Gemeinschaft wurde für eine lange Zeit (Ostern & Nicola 1996, 1997) erkannt und versucht, wirklich zu quantifizieren das Paradigma haben auch vor über einem Jahrzehnt begonnen. Ostern und Nicola (1996) ein System entwickelt, mit motorisierten rotierenden gestreiften Schlagzeug, wo die Video-Aufzeichnung der Augenbewegungen wurde manuell analysiert. Dieses System litt unter dem Mangel an Immobilisierung des Fischembryo, die häufige manuelle Neupositionierung erforderlich und könnte die Tracking-Bewegungen der Augen nur sehr schwer zu erkennen. Ein Schritt nach vorn war die Verwendung eines Video-projizierten gestreiften Trommel für mehr variable Computer generiert Reizdarbietung (Roeser & Baier, 2003. Rinner et al, 2005a) zu ermöglichen.
Die meist manuell, Frame-by-Frame-Analyse der Videoaufnahmen Aufnahmen erweist sich als äußerst mühsam, und bis zu einem gewissen Grad durch Beobachter bias (Beck et al. Behindert,2004). Automatisierte Analyse in Echtzeit wurde vorgeschlagen, um die Verwendung von Verhaltens Rückfragen Lernmechanismen (Major et al., 2004) zu ermöglichen. Der Einsatz von Infrarot-Beleuchtung und Frequenz-gesteuerten rotierenden Reize wurde von Beck et al Pionierarbeit. (2004). Das beschriebene System hat es nur für Larven verwendet wurde, und zur Analyse die off-line durchgeführt wird. Weiterhin erlaubt die vollständige Kontrolle über VisioTracker Stimuli, einschließlich Ändern des Stimulus während des Experiments, wodurch eine größere Flexibilität und spontane Einfluss auf den Verlauf des Experiments. Außerdem überwindet die digitale Impulse durch die Schaffung VisioTracker verwendet Probleme bereits erwähnt mit Beschleunigung der trägen Masse eines gestreiften Stimulus Trommel (Beck et al., 2004).
Larven Zurückhaltung Methylcellulose nicht signifikant mit der Augenbewegung stören und hat keine langfristige Auswirkungen auf Zebrafisch Wohlbefinden. Fischlarven wurden erfolgreichinstandgehalten Methylcellulose mehrere Tage eingebetteten, bis Sauerstoffzufuhr durch die Haut unzureichend für die Nachfrage mit zunehmendem Alter (Qian et al., 2005).
Die erwachsenen Fische Rückhaltemittel Methode ist ebenso einfach auf das Tier. Die kurze Dauer des Experiments, mit der Möglichkeit, schnell Austausch der Versuchstiere für einen anderen ein gekoppelt, weiter ergänzt die positiven Aspekte des Tierschutzes des Systems. Da die Kiemen kontinuierlich mit Wasser gespült werden, ist es zweckmäßig, Aufstockung der Wasser mit Chemikalien der Wahl, um seine Wirkung auf Augenbewegungen und Sehleistung zu studieren. Ebenso wird eine wash-out-Experiment kann ohne die Notwendigkeit, das zwischen den Experimenten tierischen handhaben zugesetzt werden.
Pixelrauschen im Video-Bild wurde durch Glätten des proprietären Algorithmen VisioTracker Software minimiert, so dass hochpräzise Messungen der Augenposition und Winkelgeschwindigkeit. Weiterhin erleichtert statistischenAnalyse, die Software aus Sakkaden die in festen Geschwindigkeit auftreten und nicht von dem experimentellen Anweisung beitragen filtriert. Eine Mittelung der Geschwindigkeit Kurven über 7 Video-Frames erleichtert eine spätere Analyse.
Die VisioTracker eröffnet eine neue Dimension für viele verschiedene Forschungsbereiche. Das System und seine Vorgänger bereits erfolgreich zur Sehleistung in Zebrafischlarven quantifizieren, anhand von Parametern wie Sehschärfe, Kontrastempfindlichkeit und leichte Anpassung (Rinner et al., 2005a, Schönthaler et al., 2010), für die funktionelle Analyse Zapfen-Photorezeptoren nach Manipulation der Mitglieder des visuellen transduktionskaskade (zB Rinner et al, 2005b, Renninger et al, 2011.)., oder die Analyse von Fehlsichtigkeiten in der Mutante Zebrafisch-Larven (zB Schönthaler et al, 2005, 2008;. Bahadori et al., 2006). Die Interdependenz von morphologischen und funktionellen Reifung des visuellen Systemsdurch OKR Messungen wurden untersucht, um nachzuweisen, dass die Sehschärfe hauptsächlich, aber nicht vollständig durch Photorezeptor Abstand an Larvenstadien (Haug et al., 2010) beschränkt.
Die VisioTracker eignet sich gleichermaßen zur visuellen Funktion bei erwachsenen Zebrafisch und anderen ähnlich großen Fischarten (Mueller und Neuhauss (2010), dieser Bericht) zu analysieren.
Es ist auch denkbar, das System in Forschungsbereichen wie Toxikologie oder der Pharmakologie, wobei Substanzen untersucht werden, um den Wasserfluss rund um die erwachsenen Fische Kiemen hinzugefügt werden könnten nutzen. Darüber hinaus ermöglicht die Vielseitigkeit der VisioTracker weitere gründliche Analysen z. B. der ontogenetics der Sehfunktion, neuronalen Schaltkreis-Funktion und Entwicklung oder sensomotorische Steuerung (siehe Beitrag in Huang & Neuhauss, 2008).
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
KPM wurde von EU FP7 (RETICIRC) unterstützt.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0387 |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (MS-222) | Sigma-Aldrich | E10521 |
| 35 mm cell culture dish | Corning | 430165 |
| Serum pipette | Greiner bio-one | 612 361 |
| VisioTracker | TSE Systems | 302060 |
Referanslar
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