De VisioTracker is een geautomatiseerd systeem voor de kwantitatieve analyse van de visuele prestaties van larvale en kleine volwassen vissen op basis van de registratie van oogbewegingen. Het beschikt over volledige controle over visuele stimulus eigenschappen en real-time analyse, waardoor high-throughput onderzoek op gebieden zoals visuele systeem ontwikkeling en functie, farmacologie, neurale circuit studies en sensomotorische integratie.
Onderzoek naar het visuele systeem ontwikkeling en functie noodzakelijk kwantificeerbare gedragsmodellen van visuele prestaties die gemakkelijk te lokken, robuust en eenvoudig te manipuleren. Een geschikt model is gevonden in de optokinetische reactie (OKR) een reflexieve gedrag in alle vertebraten vanwege de hoge selectiewaarde. De OKR gaat langzaam stimulus-volgende bewegingen van de ogen afgewisseld met snelle reset saccades. De meting van dit gedrag wordt gemakkelijk uitgevoerd in zebravis larven, vanwege de snelle en stabiele onset (volle na 96 uur na bevruchting (HPF)), en profiteert van de grondige kennis zebravis genetica tientallen jaren een van de favoriete model organismen in dit gebied. Inmiddels is de analyse van soortgelijke mechanismen bij volwassen vis heeft aan belang gewonnen, met name voor farmacologische en toxicologische toepassingen.
Hier beschrijven we VisioTracker, een volledig geautomatiseerde, high-throughput systeem voor de kwantitatieve analyse van de visuele prestaties. Het systeem is gebaseerd op onderzoek dat is uitgevoerd in de groep van prof. Stephan Neuhauss en werd opnieuw ontworpen door TSE Systems. Het bestaat uit een immobiliseerinrichting voor kleine vissen bewaakt door een hoogwaardige videocamera met een hoge resolutie zoomlens. De vis houder wordt omgeven door een zeeftrommel, waarop computer gegenereerde stimulus patronen worden geprojecteerd. Oogbewegingen worden geregistreerd en geanalyseerd door automatisch de VisioTracker softwarepakket in real time.
Data-analyse maakt onmiddellijke erkenning van de parameters zoals langzame en snelle faseduur, bewegingscyclus frequentie, slow-fase winst, de gezichtsscherpte en contrastgevoeligheid.
Typische resultaten laten bijvoorbeeld de snelle identificatie van visuele systeem mutanten die geen duidelijke verandering in wild-type morfologie vertonen, of de beslissing van kwantitatieve effecten van farmacologische of toxische en mutageneagenten op visuele prestaties van het systeem.
Het belang van de OKR voor de studie van de visuele functie is erkend in de wetenschappelijke gemeenschap voor een lange tijd (Pasen & Nicola 1996, 1997), en pogingen om echt te kwantificeren het paradigma hebben ruim tien jaar geleden begonnen. Pasen en Nicola (1996) ontwikkelde een systeem met gemotoriseerde roterende gestreepte drums, waar de video-opname van oogbewegingen handmatig werd geanalyseerd. Dit systeem leed aan een gebrek aan immobilisatie van de vis embryo, dat veelvuldig handmatig herpositionering nodig, en kon de tracking bewegingen van de ogen te detecteren slechts met grote moeite. Een stap vooruit was het gebruik van een video-geprojecteerde gestreepte trommel mogelijk te maken meer variabele computer gegenereerde stimulus (Roeser & Baier, 2003;. Rinner et al., 2005a).
De veelal handmatig, frame-voor-frame analyse van video opgenomen opnamen heeft bewezen zeer bewerkelijk en in zekere mate belemmerd door waarnemer bias (Beck et al..,2004). Geautomatiseerde analyse in real-time werd voorgesteld om het gebruik van gedrags feedback leermechanismen (Major et al., 2004). Mogelijk. Het gebruik van infrarood verlichting en frequentie gestuurde roterende stimuli is ontwikkeld door Beck et al.. (2004). Echter, het systeem daar beschreven is alleen gebruikt voor larven, en de analyse werd uitgevoerd off-line. Bovendien kan de VisioTracker volledige controle over stimuli, bijvoorbeeld de verandering stimulus tijdens het experiment, waardoor een grotere flexibiliteit en spontane invloed op het verloop van het experiment. Ook de creatie digitale stimulus die de problemen overwonnen VisioTracker met eerder genoemde versnelling van de massa van een inert gestreepte stimulus drum (Beck et al., 2004)..
Larven terughoudendheid van methylcellulose niet significant interfereert met oogbeweging en heeft geen lange-termijn effecten op de zebravis welzijn. Vislarven zijn met succesonderhouden ingebed in methylcellulose voor meerdere dagen, totdat de zuurstoftoevoer via de huid wordt onvoldoende zijn voor de vraag met toenemende leeftijd (Qian et al.., 2005).
De volwassen vissen straatverbod methode is net zo gemakkelijk op het dier. De korte duur van het experiment, in combinatie met de mogelijkheid snel wisselen het proefdier voor een ander, drijft de positieve dierenwelzijnsaspecten van het systeem. Aangezien de kieuwen continu gespoeld met water, is het handig om de spike water met een chemisch keuze om het effect te bestuderen op oogbewegingen en visuele prestaties. Ook een wash-out experiment worden toegevoegd zonder dat het dier tussen de experimenten behandelen.
Pixelruis in het videobeeld werd geminimaliseerd door het gladstrijken algoritmen van de specialiteit VisioTracker software, waardoor zeer precieze metingen van ooghoogte en hoeksnelheid. Bovendien vergemakkelijken statistischeanalyse de software uitgefilterd saccade bewegingen die optreden op vaste snelheid en dragen niet bij aan de experimentele statement. Een middeling van velocity curves meer dan 7 videoframes vergemakkelijkt latere analyse.
De VisioTracker opent een nieuwe dimensie voor vele gevarieerde onderzoeksgebieden. Het systeem en zijn voorgangers hebben al met succes zijn gebruikt om visuele prestaties in de zebravis larven kwantificeren, met behulp van parameters zoals gezichtsscherpte, contrastgevoeligheid en licht aanpassing (Rinner et al.., 2005a, Schonthaler et al.., 2010), voor functionele analyse van kegel fotoreceptoren na manipulatie van de leden van de visuele transductie cascade (bijv. Rinner et al., 2005b, Renninger et al., 2011.)., of de analyse van visuele gebreken in mutant zebravis larven (bijv. Schonthaler et al., 2005, 2008;. Bahadori et al.., 2006). De onderlinge afhankelijkheid van morfologische en functionele rijping van het visuele systeemis bestudeerd door OKR metingen blijkt dat gezichtsscherpte voornamelijk maar niet volledig beperkt fotoreceptor ruimte aan larvale stadia (Haug et al.., 2010).
De VisioTracker is even geschikt als visuele functie te analyseren bij volwassen zebravissen en andere vergelijkbare grootte vissoorten (Mueller en Neuhauss (2010), dit rapport).
Het is ook denkbaar om het systeem te gebruiken in onderzoeksgebieden zoals toxicologie of farmacologische waarbij stoffen worden onderzocht kunnen worden toegevoegd aan het water rond de volwassen vissen kieuwen. Bovendien is de veelzijdigheid van VisioTracker maakt grondiger analyses van bijvoorbeeld ontogenetics van de visuele functie, neurale circuit functie en ontwikkeling, of sensorimotorische controle (zie review in Huang & Neuhauss, 2008).
The authors have nothing to disclose.
KPM werd ondersteund door de EU KP7 (RETICIRC).
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
---|---|---|
Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0387 |
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (MS-222) | Sigma-Aldrich | E10521 |
35 mm cell culture dish | Corning | 430165 |
Serum pipette | Greiner bio-one | 612 361 |
VisioTracker | TSE Systems | 302060 |