Özet

Kültür sempatik nöronlar bulunan dendritik Büyüme indükleyen

Published: March 21, 2012
doi:

Özet

Bu seçici perinatal sıçan üstün servikal gangliya (SCG) ayrışmış primer sempatik nöronlar, dendritik büyümesini teşvik etmek için kemik morfogenetik protein-7 (BMP-7) veya Matrigel kullanmak için bir protokol açıklanmaktadır.

Abstract

Dendritik çardak şekli bir nöron 1-3 alabilirsiniz toplam sinaptik girdi belirler ve türleri ve bu girişlere 4-6 dağılımı etkiler. Dendritik büyüme ve plastisite Altered desen deneysel modellerde 7 bozulmuş nörodavranışsal fonksiyonu ile ilişkilidir ve nörogelişimsel bozukluklar 8-10 ve nörodejeneratif hastalıkların 11-13 hem de görülen klinik belirtiler katkıda düşünülmektedir. Bu gözlemler kesin dendritik morfoloji düzenleyen fonksiyonel öneminin altını ve dendritik büyümesini kontrol mekanizmalarının belirlenmesi sadece normal gelişimi sırasında nasıl düzenlendiği sinirsel bağlantıda anlayışını ileriye değil, aynı zamanda çeşitli nörolojik hastalıklar için yeni tedavi stratejileri üzerinde fikir verir olabileceğini düşündürmektedir.

Dendritik büyüme Mekanik çalışmalar büyük ölçüde durumu o tarafından kolaylaşırdınöronlar deneysel onlar kendi vivo nüsha ile kıyaslanabilir bir dendritik çardak detaylandırmak hangi birine dendritler uzatmak değil bir devlet değişimi yapılmasına olanak fa modeli sistemi. Perinatal kemirgenler üstün servikal gangliya (SCG) ayrışmış sempatik nöronların primer kültürlerinde böyle bir model oluşturacaktır. Serum ve ganglionik gliyal hücreleri yokluğunda tanımlandığı besiyerine zaman, sempatik nöronlar akson olan tek bir süreç uzanır ve bu durum unipolar kültürü 14,15 in ay hafta sürer. Bununla birlikte, kültür ortamına ya kemik morfogenetik protein-7 (BMP-7) veya 16,17 Matrigel 18 ilavesiyle dendritler için morfolojik, biyokimyasal ve fonksiyonel kriterlerini karşılamak birden çok işlem genişletmek için, bu nöronlar tetikler. Sempatik perinatal kemirgen SCG ayrışmış nöronlar ve tanımlanmış koşullar altında yetiştirilen nöronların 19 homojen bir nüfus vardırMatrigel, BMP-7 ve decapentaplegic (DPP) ve 60A alt familyaya 17,18,20,21 diğer BMP ve dendrit terfili aktivite düzgün cevap verdiğini. Önemli olarak, Matrigel-ve BMP indüklenen dendrit oluşumu hayatta hücre büyümesi ya akson 17,18 değişiklik olmaksızın ortaya çıkar.

Burada, biz onlar Matrigel veya BMP seçici dendrit destekleyici aktivite duyarlı böylece perinatal sıçanların SCG türetilen sempatik nöronların ayrışmış kültürleri nasıl ayarlanacağını açıklar.

Protocol

1. Kültür ortamının hazırlanması (C2 ortamı) Steril, tek kullanımlık 500 ml Erlenmeyer şişesine, listelenen sırada, aşağıdakileri ekleyin: Miktar Bileşen Nihai konsantrasyon 190 ml DMEM (düşük glukoz) N / A 10 ml yağ asidi serbest BSA (DMEM 20mg/ml) 50 mcg / ml 2.8 ml L-Glutamine <…

Discussion

Bu model avantajları şunlardır: (a) kültürler, diğer hücre tipleri 17,23 yoksun sempatik nöronlar, homojen bir nüfusu oluşur, (b) simpatetik nöronlar büyüme faktörü gereksinimleri kullanımına olanak sağlamaktadır ki, iyi kurulmuş bulunmaktadır tanımlanan orta ve tanımlanan çeşitli medya ve yüzeyler 23 büyüyen ve sempatik nöronlar sürdürmek için iyi çalışır; (c) Bu kültürlerinde nöronlar Matrigel, BMP-7 ve DPP diğer BMP ve dendrit terfili aktivite düzgün cev…

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (hibe NS45037 R21 ve R01 ES014901) fon tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Yorumlar
Glass coverslips Bellco 1943-10012 12 mm Round Coverslip #1 Thickness, German glass
Bent tip pipets Bellco 1273-50003  
Poly-D-lysine Sigma P0899-100MG Stock solution 1 mg/ml
Distilled water Gibco 15230  
Fine forceps Dumont no. 4 and 5 Fine Science Tools (FST) 11252-30 11241-30  
20-gauge needles Becton Dickinson 305176  
Leibovitz’s L-15 medium Invitrogen 11415  
Collagenase Worthington 4176 1 mg/ml
Dispase Roche 04942078001 5 mg/ml
Hank’s balanced salt solution( -Ca,-Mg) Invitrogen 14185-052  
DMEM Low glucose Invitrogen 11885  
L-Glutamine Invitrogen 25030 20 mM
Insulin/Transferrin/ Selenium Invitrogen 51500-056 100X
Fatty-acid free BSA Calbiochem 126609  
NGF Harlan Bioproducts 5017  
Ham F-12 nutrient medium (F-12) Invitrogen 11765  
Cytosine arabinoside Sigma C1768  
Matrigel BD Biosciences 356234 Avoid repeated freeze-thaw cycles
BMP-7 R&D Systems Curis, Inc. 345-BP BMP7-07H BMPs 4, 5 and 6 work equally as well as BMP-7 and are sometimes easier to obtain commercially
Paraformaldehyde Sigma P6148  
Triton X-100 Fisher BP151-500  
Mouse anti-rat MAP2 antibody Sternberg Monoclonals Inc. SMI52 1/5000
Alexa Fluor 546 goat-anti-mouse Invitrogen A11003 1/10000
Mounting media Prolong Antifade kit Molecular Probes P7481  

Table 1. Materials.

Referanslar

  1. Purpura, D. P., Quarton, Q. C., Melnechuk, T., Schmitt, F. O. . The Neurosciences: A Study Program. , 372-393 (1967).
  2. Purves, D. Functional and structural changes in mammalian sympathetic neurons following interruption of their axons. J. Physiol. 252, 429-463 (1975).
  3. Purves, D. . A Trophic Theory of Neural Connections. , (1988).
  4. Miller, J. P., Jacobs, G. A. Relationships between neuronal structure and function. J. Exp. Biol. 112, 129-145 (1984).
  5. Schuman, E. M. Synapse specificity and long-term information storage. Neuron. 18, 339-342 (1997).
  6. Sejnowski, T. J. The year of the dendrite. Science. 275, 178-179 (1997).
  7. Berger-Sweeney, J., Hohmann, C. F. Behavioral consequences of abnormal cortical development: insights into developmental disabilities. Behav. Brain Res. 86, 121-142 (1997).
  8. Connors, S. L. Fetal mechanisms in neurodevelopmental disorders. Pediatric Neurology. 38, 163-176 (2008).
  9. Pardo, C. A., Eberhart, C. G. The neurobiology of autism. Brain Pathology (Zurich, Switzerland). 17, 434-447 (2007).
  10. Zoghbi, H. Y. Postnatal neurodevelopmental disorders: meeting at the synapse. Science. 302, 826-830 (2003).
  11. de Ruiter, J. P., Uylings, H. B. Morphometric and dendritic analysis of fascia dentata granule cells in human aging and senile dementia. Brain Res. 402, 217-229 (1987).
  12. Flood, D. G., Coleman, P. D. Hippocampal plasticity in normal aging and decreased plasticity in Alzheimer’s disease. Prog. Brain Res. 83, 435-443 (1990).
  13. Jagadha, V., Becker, L. E. Dendritic pathology: an overview of Golgi studies in man. Can. J. Neurol. Sci. 16, 41-50 (1989).
  14. Bruckenstein, D. A., Higgins, D. Morphological differentiation of embryonic rat sympathetic neurons in tissue culture. I. Conditions under which neurons form axons but not dendrites. Dev. Biol. 128, 324-336 (1988).
  15. Tropea, M., Johnson, M. I., Higgins, D. Glial cells promote dendritic development in rat sympathetic neurons in vitro. Glia. 1, 380-392 (1988).
  16. Lein, P. The effects of extracellular matrix and osteogenic protein-1 on the morphological differentiation of rat sympathetic neurons. Int. J. Dev. Neurosci. 14, 203-215 (1996).
  17. Lein, P., Johnson, M., Guo, X., Rueger, D., Higgins, D. Osteogenic protein-1 induces dendritic growth in rat sympathetic neurons. Neuron. 15, 597-605 (1995).
  18. Lein, P. J., Higgins, D. Laminin and a basement membrane extract have different effects on axonal and dendritic outgrowth from embryonic rat sympathetic neurons in vitro. 136, 330-345 (1989).
  19. Higgins, D., Lein, P. J., Osterhout, D. J., Johnson, M. I., Banker, G., Goslin, K. . Culturing Nerve Cells. , 177-295 (1991).
  20. Beck, H. N., Drahushuk, K., Jacoby, D. B., Higgins, D., Lein, P. J. Bone morphogenetic protein-5 (BMP-5) promotes dendritic growth in cultured sympathetic neurons. BMC Neurosci. 2, 12-12 (2001).
  21. Guo, X., Rueger, D., Higgins, D. Osteogenic protein-1 and related bone morphogenetic proteins regulate dendritic growth and the expression of microtubule-associated protein-2 in rat sympathetic neurons. Neurosci. Lett. 245, 131-134 (1998).
  22. Lein, P. J. Glia induce dendritic growth in cultured sympathetic neurons by modulating the balance between bone morphogenetic proteins (BMPs) and BMP antagonists. J. Neurosci. 22, 10377-10387 (2002).
  23. Higgins, D., Lein, P., Osterhout, D., Johnson, M. I., Banker, G., Goslin, K. . Culturing Nerve Cells. , 177-205 (1991).
  24. Bruckenstein, D. A., Higgins, D. Morphological differentiation of embryonic rat sympathetic neurons in tissue culture. II. Serum promotes dendritic growth. Dev. Biol. 128, 337-348 (1988).

Play Video

Bu Makaleden Alıntı Yapın
Ghogha, A., Bruun, D. A., Lein, P. J. Inducing Dendritic Growth in Cultured Sympathetic Neurons. J. Vis. Exp. (61), e3546, doi:10.3791/3546 (2012).

View Video