Özet

גרימת צמיחה הדנדריטים בנוירונים אוהדים מתורבתים

Published: March 21, 2012
doi:

Özet

אנו מתארים באמצעות פרוטוקול המוךפו"גנטי שהולך העצם חלבונים 7 (BMP-7) או Matrigel סלקטיבי לגרום לצמיחה הדנדריטים בנוירונים אוהדים העיקריים הסתייגותם מן הגרעינים צוואר הרחם מעולה (SCG) של חולדות הלידה.

Abstract

הצורה של הדנדריטים ארבור קובע את הקלט הסינפטי הכולל תא עצב יכול לקבל 1-3, ומשפיע סוגי והפצה של תשומות אלה 4-6. דפוסי שינה של צמיחה הפלסטיות דנדריטים והן קשורות עם תפקוד לקוי neurobehavioral במודלים ניסיוניים 7, והם חשבו לתרום סימפטומים קליניים שנצפה בשתי 8-10 הפרעות התפתחותיות ומחלות ניווניות 11-13. תצפיות אלו מדגישים את החשיבות התפקודית של ויסות בדיוק מורפולוגיה הדנדריטים, וסבורים כי מנגנוני זיהוי השולטים הצמיחה הדנדריטים לא רק לקדם את ההבנה של כמה עצבי קישוריות מוסדר במהלך התפתחות תקינה, אבל עשויה גם לספק תובנות על אסטרטגיות טיפולית חדשנית למחלות נוירולוגיות שונות.

מחקרים שיבדקו את המנגנונים של צמיחת הדנדריטים יהיה להקל במידה רבה על ידי זמינות Ofa מערכת מודל המאפשר נוירונים כדי לפעול באופן ניסיוני ממצב שבו הם לא להאריך דנדריטים אחד שבו הם לפרט ארבור הדנדריטים דומה לזה של עמיתיהם שלהם vivo. תרבויות העיקריות של נוירונים אוהדים הסתייגותם מן הגרעינים צוואר הרחם מעולה (SCG) של מכרסמים סביב הלידה לספק מודל כזה. כאשר בתרבית מוגדר בינוני בהעדר מתאי גליה בסרום ו ganglionic, הנוירונים אוהדים להאריך את תהליך יחיד אשר axonal, ואת זה המדינה חד קוטבי נמשכת שבועות עד חודשים בתרבות 14,15. עם זאת, תוספת של המוךפו"גנטי שהולך או עצם חלבונים 7 (BMP-7) 16,17 או 18 Matrigel עד בינוני התרבות מפעילה נוירונים אלה כדי להרחיב את התהליכים רבים העונים על קריטריונים מורפולוגיים, ביוכימיים ופונקציונלי של דנדריטים. נוירונים אוהדים הסתייגותם מן SCG של מכרסמים סביב הלידה ו שגודלו בתנאים מוגדרים הם אוכלוסייה הומוגנית של נוירונים 19שמגיבים בצורה אחידה לפעילות דנדריט, קידום של Matrigel, BMP-7 ו BMPs אחרים של decapentaplegic (DPP) ו 60A subfamilies 17,18,20,21. חשוב לציין, Matrigel-BMP ו-Induced דנדריט היווצרות מתרחשת בהיעדר שינויים הישרדות התא או צמיחה axonal 17,18.

כאן, נתאר כיצד להגדיר את תרבויות הסתייגותם של נוירונים אוהדים הנגזרות SCG של חולדות סביב הלידה, כך שהם מגיבים על פעילות דנדריט, קידום סלקטיבי של Matrigel או BMPs.

Protocol

1. הכנת בינוני תרבות (בינוני C2) להוסיף את הדברים הבאים, על מנת ברשימה, כדי סטרילית, חד פעמי בקבוק 500 מ"ל Erlenmeyer: כמות רכיב ריכוז סופי <tr…

Discussion

היתרונות של מודל זה הם: (א) תרבויות מורכבות של אוכלוסייה הומוגנית של נוירונים אוהדים חסרי סוגי תאים אחרים 17,23 (ב) גורם הגדילה הדרישות של נוירונים הם אוהדים מבוססת היטב, אשר מאפשר את השימוש בינוני מוגדר, וכן מגוון של כלי התקשורת מוגדרים, מצעים לעבוד היטב לגידול ושמ…

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי מימון מן המכון הלאומי לבריאות (מענקים R21 ו R01 NS45037 ES014901).

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Yorumlar
Glass coverslips Bellco 1943-10012 12 mm Round Coverslip #1 Thickness, German glass
Bent tip pipets Bellco 1273-50003  
Poly-D-lysine Sigma P0899-100MG Stock solution 1 mg/ml
Distilled water Gibco 15230  
Fine forceps Dumont no. 4 and 5 Fine Science Tools (FST) 11252-30 11241-30  
20-gauge needles Becton Dickinson 305176  
Leibovitz’s L-15 medium Invitrogen 11415  
Collagenase Worthington 4176 1 mg/ml
Dispase Roche 04942078001 5 mg/ml
Hank’s balanced salt solution( -Ca,-Mg) Invitrogen 14185-052  
DMEM Low glucose Invitrogen 11885  
L-Glutamine Invitrogen 25030 20 mM
Insulin/Transferrin/ Selenium Invitrogen 51500-056 100X
Fatty-acid free BSA Calbiochem 126609  
NGF Harlan Bioproducts 5017  
Ham F-12 nutrient medium (F-12) Invitrogen 11765  
Cytosine arabinoside Sigma C1768  
Matrigel BD Biosciences 356234 Avoid repeated freeze-thaw cycles
BMP-7 R&D Systems Curis, Inc. 345-BP BMP7-07H BMPs 4, 5 and 6 work equally as well as BMP-7 and are sometimes easier to obtain commercially
Paraformaldehyde Sigma P6148  
Triton X-100 Fisher BP151-500  
Mouse anti-rat MAP2 antibody Sternberg Monoclonals Inc. SMI52 1/5000
Alexa Fluor 546 goat-anti-mouse Invitrogen A11003 1/10000
Mounting media Prolong Antifade kit Molecular Probes P7481  

Table 1. Materials.

Referanslar

  1. Purpura, D. P., Quarton, Q. C., Melnechuk, T., Schmitt, F. O. . The Neurosciences: A Study Program. , 372-393 (1967).
  2. Purves, D. Functional and structural changes in mammalian sympathetic neurons following interruption of their axons. J. Physiol. 252, 429-463 (1975).
  3. Purves, D. . A Trophic Theory of Neural Connections. , (1988).
  4. Miller, J. P., Jacobs, G. A. Relationships between neuronal structure and function. J. Exp. Biol. 112, 129-145 (1984).
  5. Schuman, E. M. Synapse specificity and long-term information storage. Neuron. 18, 339-342 (1997).
  6. Sejnowski, T. J. The year of the dendrite. Science. 275, 178-179 (1997).
  7. Berger-Sweeney, J., Hohmann, C. F. Behavioral consequences of abnormal cortical development: insights into developmental disabilities. Behav. Brain Res. 86, 121-142 (1997).
  8. Connors, S. L. Fetal mechanisms in neurodevelopmental disorders. Pediatric Neurology. 38, 163-176 (2008).
  9. Pardo, C. A., Eberhart, C. G. The neurobiology of autism. Brain Pathology (Zurich, Switzerland). 17, 434-447 (2007).
  10. Zoghbi, H. Y. Postnatal neurodevelopmental disorders: meeting at the synapse. Science. 302, 826-830 (2003).
  11. de Ruiter, J. P., Uylings, H. B. Morphometric and dendritic analysis of fascia dentata granule cells in human aging and senile dementia. Brain Res. 402, 217-229 (1987).
  12. Flood, D. G., Coleman, P. D. Hippocampal plasticity in normal aging and decreased plasticity in Alzheimer’s disease. Prog. Brain Res. 83, 435-443 (1990).
  13. Jagadha, V., Becker, L. E. Dendritic pathology: an overview of Golgi studies in man. Can. J. Neurol. Sci. 16, 41-50 (1989).
  14. Bruckenstein, D. A., Higgins, D. Morphological differentiation of embryonic rat sympathetic neurons in tissue culture. I. Conditions under which neurons form axons but not dendrites. Dev. Biol. 128, 324-336 (1988).
  15. Tropea, M., Johnson, M. I., Higgins, D. Glial cells promote dendritic development in rat sympathetic neurons in vitro. Glia. 1, 380-392 (1988).
  16. Lein, P. The effects of extracellular matrix and osteogenic protein-1 on the morphological differentiation of rat sympathetic neurons. Int. J. Dev. Neurosci. 14, 203-215 (1996).
  17. Lein, P., Johnson, M., Guo, X., Rueger, D., Higgins, D. Osteogenic protein-1 induces dendritic growth in rat sympathetic neurons. Neuron. 15, 597-605 (1995).
  18. Lein, P. J., Higgins, D. Laminin and a basement membrane extract have different effects on axonal and dendritic outgrowth from embryonic rat sympathetic neurons in vitro. 136, 330-345 (1989).
  19. Higgins, D., Lein, P. J., Osterhout, D. J., Johnson, M. I., Banker, G., Goslin, K. . Culturing Nerve Cells. , 177-295 (1991).
  20. Beck, H. N., Drahushuk, K., Jacoby, D. B., Higgins, D., Lein, P. J. Bone morphogenetic protein-5 (BMP-5) promotes dendritic growth in cultured sympathetic neurons. BMC Neurosci. 2, 12-12 (2001).
  21. Guo, X., Rueger, D., Higgins, D. Osteogenic protein-1 and related bone morphogenetic proteins regulate dendritic growth and the expression of microtubule-associated protein-2 in rat sympathetic neurons. Neurosci. Lett. 245, 131-134 (1998).
  22. Lein, P. J. Glia induce dendritic growth in cultured sympathetic neurons by modulating the balance between bone morphogenetic proteins (BMPs) and BMP antagonists. J. Neurosci. 22, 10377-10387 (2002).
  23. Higgins, D., Lein, P., Osterhout, D., Johnson, M. I., Banker, G., Goslin, K. . Culturing Nerve Cells. , 177-205 (1991).
  24. Bruckenstein, D. A., Higgins, D. Morphological differentiation of embryonic rat sympathetic neurons in tissue culture. II. Serum promotes dendritic growth. Dev. Biol. 128, 337-348 (1988).

Play Video

Bu Makaleden Alıntı Yapın
Ghogha, A., Bruun, D. A., Lein, P. J. Inducing Dendritic Growth in Cultured Sympathetic Neurons. J. Vis. Exp. (61), e3546, doi:10.3791/3546 (2012).

View Video