אנו מתארים באמצעות פרוטוקול המוךפו"גנטי שהולך העצם חלבונים 7 (BMP-7) או Matrigel סלקטיבי לגרום לצמיחה הדנדריטים בנוירונים אוהדים העיקריים הסתייגותם מן הגרעינים צוואר הרחם מעולה (SCG) של חולדות הלידה.
הצורה של הדנדריטים ארבור קובע את הקלט הסינפטי הכולל תא עצב יכול לקבל 1-3, ומשפיע סוגי והפצה של תשומות אלה 4-6. דפוסי שינה של צמיחה הפלסטיות דנדריטים והן קשורות עם תפקוד לקוי neurobehavioral במודלים ניסיוניים 7, והם חשבו לתרום סימפטומים קליניים שנצפה בשתי 8-10 הפרעות התפתחותיות ומחלות ניווניות 11-13. תצפיות אלו מדגישים את החשיבות התפקודית של ויסות בדיוק מורפולוגיה הדנדריטים, וסבורים כי מנגנוני זיהוי השולטים הצמיחה הדנדריטים לא רק לקדם את ההבנה של כמה עצבי קישוריות מוסדר במהלך התפתחות תקינה, אבל עשויה גם לספק תובנות על אסטרטגיות טיפולית חדשנית למחלות נוירולוגיות שונות.
מחקרים שיבדקו את המנגנונים של צמיחת הדנדריטים יהיה להקל במידה רבה על ידי זמינות Ofa מערכת מודל המאפשר נוירונים כדי לפעול באופן ניסיוני ממצב שבו הם לא להאריך דנדריטים אחד שבו הם לפרט ארבור הדנדריטים דומה לזה של עמיתיהם שלהם vivo. תרבויות העיקריות של נוירונים אוהדים הסתייגותם מן הגרעינים צוואר הרחם מעולה (SCG) של מכרסמים סביב הלידה לספק מודל כזה. כאשר בתרבית מוגדר בינוני בהעדר מתאי גליה בסרום ו ganglionic, הנוירונים אוהדים להאריך את תהליך יחיד אשר axonal, ואת זה המדינה חד קוטבי נמשכת שבועות עד חודשים בתרבות 14,15. עם זאת, תוספת של המוךפו"גנטי שהולך או עצם חלבונים 7 (BMP-7) 16,17 או 18 Matrigel עד בינוני התרבות מפעילה נוירונים אלה כדי להרחיב את התהליכים רבים העונים על קריטריונים מורפולוגיים, ביוכימיים ופונקציונלי של דנדריטים. נוירונים אוהדים הסתייגותם מן SCG של מכרסמים סביב הלידה ו שגודלו בתנאים מוגדרים הם אוכלוסייה הומוגנית של נוירונים 19שמגיבים בצורה אחידה לפעילות דנדריט, קידום של Matrigel, BMP-7 ו BMPs אחרים של decapentaplegic (DPP) ו 60A subfamilies 17,18,20,21. חשוב לציין, Matrigel-BMP ו-Induced דנדריט היווצרות מתרחשת בהיעדר שינויים הישרדות התא או צמיחה axonal 17,18.
כאן, נתאר כיצד להגדיר את תרבויות הסתייגותם של נוירונים אוהדים הנגזרות SCG של חולדות סביב הלידה, כך שהם מגיבים על פעילות דנדריט, קידום סלקטיבי של Matrigel או BMPs.
היתרונות של מודל זה הם: (א) תרבויות מורכבות של אוכלוסייה הומוגנית של נוירונים אוהדים חסרי סוגי תאים אחרים 17,23 (ב) גורם הגדילה הדרישות של נוירונים הם אוהדים מבוססת היטב, אשר מאפשר את השימוש בינוני מוגדר, וכן מגוון של כלי התקשורת מוגדרים, מצעים לעבוד היטב לגידול ושמ…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי מימון מן המכון הלאומי לבריאות (מענקים R21 ו R01 NS45037 ES014901).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Yorumlar |
Glass coverslips | Bellco | 1943-10012 | 12 mm Round Coverslip #1 Thickness, German glass |
Bent tip pipets | Bellco | 1273-50003 | |
Poly-D-lysine | Sigma | P0899-100MG | Stock solution 1 mg/ml |
Distilled water | Gibco | 15230 | |
Fine forceps Dumont no. 4 and 5 | Fine Science Tools (FST) | 11252-30 11241-30 | |
20-gauge needles | Becton Dickinson | 305176 | |
Leibovitz’s L-15 medium | Invitrogen | 11415 | |
Collagenase | Worthington | 4176 | 1 mg/ml |
Dispase | Roche | 04942078001 | 5 mg/ml |
Hank’s balanced salt solution( -Ca,-Mg) | Invitrogen | 14185-052 | |
DMEM Low glucose | Invitrogen | 11885 | |
L-Glutamine | Invitrogen | 25030 | 20 mM |
Insulin/Transferrin/ Selenium | Invitrogen | 51500-056 | 100X |
Fatty-acid free BSA | Calbiochem | 126609 | |
NGF | Harlan Bioproducts | 5017 | |
Ham F-12 nutrient medium (F-12) | Invitrogen | 11765 | |
Cytosine arabinoside | Sigma | C1768 | |
Matrigel | BD Biosciences | 356234 | Avoid repeated freeze-thaw cycles |
BMP-7 | R&D Systems Curis, Inc. | 345-BP BMP7-07H | BMPs 4, 5 and 6 work equally as well as BMP-7 and are sometimes easier to obtain commercially |
Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
Triton X-100 | Fisher | BP151-500 | |
Mouse anti-rat MAP2 antibody | Sternberg Monoclonals Inc. | SMI52 | 1/5000 |
Alexa Fluor 546 goat-anti-mouse | Invitrogen | A11003 | 1/10000 |
Mounting media | Prolong Antifade kit Molecular Probes | P7481 |
Table 1. Materials.