Özet

Induire la croissance dendritique dans des cultures de neurones sympathiques

Published: March 21, 2012
doi:

Özet

Nous décrivons un protocole pour l'utilisation de protéines morphogénétiques osseuses-7 (BMP-7) ou Matrigel pour induire sélectivement la croissance dendritique dans les neurones sympathiques dissociés primaires des ganglions cervicaux supérieurs (SCG) de rats périnatales.

Abstract

La forme de la dendritique arbre détermine l'apport total synaptique d'un neurone peut recevoir 1-3, et influe sur les types et la distribution de ces intrants 4-6. Modification des modes de croissance dendritique et la plasticité sont associés à la fonction neurocomportementale avec facultés affaiblies dans les modèles expérimentaux 7, et sont pensés pour contribuer à des symptômes cliniques observés dans les deux troubles neurodéveloppementaux 8-10 et les maladies neurodégénératives 11-13. Ces observations soulignent l'importance fonctionnelle de la régulation précisément la morphologie dendritique, et suggèrent que l'identification des mécanismes qui contrôlent la croissance dendritique ne sera pas seulement faire progresser la compréhension de la façon dont la connectivité neuronale est régulée au cours du développement normal, mais peut également donner un aperçu sur les nouvelles stratégies thérapeutiques pour diverses maladies neurologiques.

Des études mécanistiques de la croissance dendritique serait grandement facilitée par la disponibilité osystème modèle FA qui permet aux neurones à titre expérimental est passé d'un état ​​dans lequel ils ne s'étendent pas aux dendrites celui dans lequel ils élaborent un arbre dendritique comparable à celle de leur homologues dans les in vivo. Les cultures primaires de neurones sympathiques dissociés de ganglions cervicaux supérieurs (SCG) de rongeurs périnatales fournir un tel modèle. Lorsqu'elle est cultivée dans un milieu défini en l'absence de sérum et les cellules gliales ganglionnaire, les neurones sympathiques d'étendre un processus unique qui est axonale, et cet état ​​persiste pendant unipolaire semaines à plusieurs mois dans la culture 14,15. Cependant, l'ajout de protéines soit morphogénétique osseuse-7 (BMP-7) 16,17 ou 18 à Matrigel le milieu de culture déclenche ces neurones d'étendre les processus multiples qui répondent aux critères morphologiques, biochimiques et fonctionnelles pour les dendrites. Neurones sympathiques dissociés de la CTB de rongeurs périnatales et cultivés dans des conditions définies sont une population homogène de neurones 19qui répondent de manière uniforme à l'activité dendrite-promotion de Matrigel, BMP-7 et autres PGB de la decapentaplegic (DPP) et 60A sous-familles 17,18,20,21. Important, le Matrigel-et BMP-induite dendrite formation se produit en l'absence de changements de la survie des cellules ou la croissance des axones 17,18.

Ici, nous décrivons comment mettre en place des cultures dissociées de neurones sympathiques provenant de la CTB de rats périnatales afin qu'ils soient adaptés à l'sélective dendrite-promotion de l'activité de Matrigel ou MPG.

Protocol

1. Préparation du milieu de culture (milieu C2) Ajoutez les lignes suivantes, dans l'ordre indiqué, à un stérile, flacon de 500 ml à usage unique Erlenmeyer: Montant Composant Concentration finale 190 ml DMEM (faible taux de glucose) N / A 10 ml acides gras libres BSA (20mg/ml dans du DMEM) 50 pg / ml …

Discussion

Les avantages de ce modèle comprennent: (a) les cultures sont composées d'une population homogène de neurones sympathiques dépourvus d'autres types cellulaires 17,23; (b) les exigences du facteur de croissance des neurones sympathiques sont bien établies, ce qui permet l'utilisation de milieu défini, et une variété de milieux définis, et les substrats fonctionnent bien pour la croissance et le maintien de neurones sympathiques 23; (c) les neurones dans ces cultures de répondre…

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par le financement de la National Institutes of Health (subventions R21 et R01 NS45037 ES014901).

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Yorumlar
Glass coverslips Bellco 1943-10012 12 mm Round Coverslip #1 Thickness, German glass
Bent tip pipets Bellco 1273-50003  
Poly-D-lysine Sigma P0899-100MG Stock solution 1 mg/ml
Distilled water Gibco 15230  
Fine forceps Dumont no. 4 and 5 Fine Science Tools (FST) 11252-30 11241-30  
20-gauge needles Becton Dickinson 305176  
Leibovitz’s L-15 medium Invitrogen 11415  
Collagenase Worthington 4176 1 mg/ml
Dispase Roche 04942078001 5 mg/ml
Hank’s balanced salt solution( -Ca,-Mg) Invitrogen 14185-052  
DMEM Low glucose Invitrogen 11885  
L-Glutamine Invitrogen 25030 20 mM
Insulin/Transferrin/ Selenium Invitrogen 51500-056 100X
Fatty-acid free BSA Calbiochem 126609  
NGF Harlan Bioproducts 5017  
Ham F-12 nutrient medium (F-12) Invitrogen 11765  
Cytosine arabinoside Sigma C1768  
Matrigel BD Biosciences 356234 Avoid repeated freeze-thaw cycles
BMP-7 R&D Systems Curis, Inc. 345-BP BMP7-07H BMPs 4, 5 and 6 work equally as well as BMP-7 and are sometimes easier to obtain commercially
Paraformaldehyde Sigma P6148  
Triton X-100 Fisher BP151-500  
Mouse anti-rat MAP2 antibody Sternberg Monoclonals Inc. SMI52 1/5000
Alexa Fluor 546 goat-anti-mouse Invitrogen A11003 1/10000
Mounting media Prolong Antifade kit Molecular Probes P7481  

Table 1. Materials.

Referanslar

  1. Purpura, D. P., Quarton, Q. C., Melnechuk, T., Schmitt, F. O. . The Neurosciences: A Study Program. , 372-393 (1967).
  2. Purves, D. Functional and structural changes in mammalian sympathetic neurons following interruption of their axons. J. Physiol. 252, 429-463 (1975).
  3. Purves, D. . A Trophic Theory of Neural Connections. , (1988).
  4. Miller, J. P., Jacobs, G. A. Relationships between neuronal structure and function. J. Exp. Biol. 112, 129-145 (1984).
  5. Schuman, E. M. Synapse specificity and long-term information storage. Neuron. 18, 339-342 (1997).
  6. Sejnowski, T. J. The year of the dendrite. Science. 275, 178-179 (1997).
  7. Berger-Sweeney, J., Hohmann, C. F. Behavioral consequences of abnormal cortical development: insights into developmental disabilities. Behav. Brain Res. 86, 121-142 (1997).
  8. Connors, S. L. Fetal mechanisms in neurodevelopmental disorders. Pediatric Neurology. 38, 163-176 (2008).
  9. Pardo, C. A., Eberhart, C. G. The neurobiology of autism. Brain Pathology (Zurich, Switzerland). 17, 434-447 (2007).
  10. Zoghbi, H. Y. Postnatal neurodevelopmental disorders: meeting at the synapse. Science. 302, 826-830 (2003).
  11. de Ruiter, J. P., Uylings, H. B. Morphometric and dendritic analysis of fascia dentata granule cells in human aging and senile dementia. Brain Res. 402, 217-229 (1987).
  12. Flood, D. G., Coleman, P. D. Hippocampal plasticity in normal aging and decreased plasticity in Alzheimer’s disease. Prog. Brain Res. 83, 435-443 (1990).
  13. Jagadha, V., Becker, L. E. Dendritic pathology: an overview of Golgi studies in man. Can. J. Neurol. Sci. 16, 41-50 (1989).
  14. Bruckenstein, D. A., Higgins, D. Morphological differentiation of embryonic rat sympathetic neurons in tissue culture. I. Conditions under which neurons form axons but not dendrites. Dev. Biol. 128, 324-336 (1988).
  15. Tropea, M., Johnson, M. I., Higgins, D. Glial cells promote dendritic development in rat sympathetic neurons in vitro. Glia. 1, 380-392 (1988).
  16. Lein, P. The effects of extracellular matrix and osteogenic protein-1 on the morphological differentiation of rat sympathetic neurons. Int. J. Dev. Neurosci. 14, 203-215 (1996).
  17. Lein, P., Johnson, M., Guo, X., Rueger, D., Higgins, D. Osteogenic protein-1 induces dendritic growth in rat sympathetic neurons. Neuron. 15, 597-605 (1995).
  18. Lein, P. J., Higgins, D. Laminin and a basement membrane extract have different effects on axonal and dendritic outgrowth from embryonic rat sympathetic neurons in vitro. 136, 330-345 (1989).
  19. Higgins, D., Lein, P. J., Osterhout, D. J., Johnson, M. I., Banker, G., Goslin, K. . Culturing Nerve Cells. , 177-295 (1991).
  20. Beck, H. N., Drahushuk, K., Jacoby, D. B., Higgins, D., Lein, P. J. Bone morphogenetic protein-5 (BMP-5) promotes dendritic growth in cultured sympathetic neurons. BMC Neurosci. 2, 12-12 (2001).
  21. Guo, X., Rueger, D., Higgins, D. Osteogenic protein-1 and related bone morphogenetic proteins regulate dendritic growth and the expression of microtubule-associated protein-2 in rat sympathetic neurons. Neurosci. Lett. 245, 131-134 (1998).
  22. Lein, P. J. Glia induce dendritic growth in cultured sympathetic neurons by modulating the balance between bone morphogenetic proteins (BMPs) and BMP antagonists. J. Neurosci. 22, 10377-10387 (2002).
  23. Higgins, D., Lein, P., Osterhout, D., Johnson, M. I., Banker, G., Goslin, K. . Culturing Nerve Cells. , 177-205 (1991).
  24. Bruckenstein, D. A., Higgins, D. Morphological differentiation of embryonic rat sympathetic neurons in tissue culture. II. Serum promotes dendritic growth. Dev. Biol. 128, 337-348 (1988).

Play Video

Bu Makaleden Alıntı Yapın
Ghogha, A., Bruun, D. A., Lein, P. J. Inducing Dendritic Growth in Cultured Sympathetic Neurons. J. Vis. Exp. (61), e3546, doi:10.3791/3546 (2012).

View Video