Caratterizzazione elettrofisiologica di GFP-Esprimendo popolazioni di cellule nella retina intatto

La seguente descrizione presuppone che lo sperimentatore ha una conoscenza di base della struttura della retina, patch-clamp la registrazione e la microscopia a due fotoni. Per informazioni utili sulla realizzazione e il funzionamento di una patch-clamp setup e due fotoni sistema di imaging vedere Rif [7-12]. 1. Animali e di preparazione dei tessuti Tenere il mouse adattato all'oscurità per almeno 3 ore Nel frattempo, preparare 1-2 l di soluzione extracellulare costituito da (in mM) 125 NaCl, 2.5 KCl, 1 CaCl 2, 1,6 MgCl 2, 25 NaHCO 3, 10 D-glucosio ed equilibrare a pH 7.4 con il gas con CarboGen (5% di CO 2 in O 2) a temperatura ambiente. un Euthanize il mouse in una tenuta d'aria da camera di CO 2 overdose seguita da dislocazione cervicale. Questa procedura e le seguenti operazioni devono essere eseguite nelle tenebre. Utilizzare dim lunghezza d'onda di illuminazione (lunghezze d'onda di bloccare dei passi da una fonte di luce fredda da un 690 nm-longpass filtro) per sostenere una visione personale, mantenendo gli occhi dell'animale scuro-adattato (topi hanno solo una visione povera nella parte rossa dello spettro della luce). Per i lavori di illuminazione completo uso tenebre infrarossi (> 800 nm) e indossare occhiali per visione notturna. Enucleare gli occhi con un paio di forbici curve iris e trasferirli in un piatto di soluzione extracellulare posta sotto un microscopio da dissezione. Rimuovere la cornea e il corpo ciliare aprendo il bulbo dell'occhio lungo la serrata (al confine tra retina e corpo ciliare) con un paio di forbici a molla (per prima cosa usare un bisturi per forare un punto di partenza per il taglio). Togliere le lenti e attentamente separato la retina da dell'epitelio pigmentato. Se l'orientamento della retina è cruciale per il vostro studio, indicare piace in Ref. [12]. Tagliare il nervo ottico tra retina e dell'epitelio pigmentato e rimuovere la retina dalla oculare. Si noti la direzione delle superfici della retina: la parte interna del arricciato-up retina è la Gangllato celle Ioni; l'esterno è il lato dei fotorecettori. Rimuovere il vitreo dalla superficie interna della retina con delicatezza tirando fuori con l'aiuto di uno stuzzicadenti di legno. A tal fine, utilizzare un piccolo volume di soluzione extracellulare che copre appena la retina. I bastoncini vitreo per lo stuzzicadenti e possono essere trascinati fuori centrifuga della retina. Quindi, applicare incisioni breve lungo il perimetro della retina per facilitare l'appiattimento del tessuto. Trasferire la retina nella camera di registrazione fotorecettore rivolto verso il basso, lo stese sul fondo di vetro (si usa un pennello fine) e immobilizzare con una con corde in nylon telaio in acciaio inossidabile. Preparare la retina secondo nello stesso modo e tenerlo scuro-adattato in carboxygenated soluzione extracellulare per un uso successivo. 2. Registrazioni Installare la camera di registrazione al buio sotto un microscopio laser a scansione verticale e superfuse la preparazione della retina continuamente (non inferiore a 5 ml / min) con carboxygenated soluzione extracellulare riscaldata a 35 ° C. Il microscopio (anche dotato di una lampada sensibile camera CCD) si trova su una ammortizzante tavolo aria all'interno di una gabbia di Faraday per elettronica schermatura. Coprire la gabbia con un non-tenda trasparente per mantenere la preparazione al buio. Abbiamo anche a schermo spento la luce dal monitor dei computer da rosso pellicola trasparente. Tune il laser a infrarossi per 850-870 nm o lunghezze d'onda maggiori, passare alla modalità-locked condizione, e l'uso di eccitazione a due fotoni per visualizzare GFP cellule che esprimono. Attenuare la potenza laser utilizzando filtri a densità neutra controllata dal software di scansione laser fino a un grado che è appena sufficiente per un chiaro riconoscimento della cellula fluorescente Per i patch-clamp registrazioni in current-clamp micropipette utilizzare la modalità di vetro (usiamo tubi in vetro borosilicato di 1,5 mm di diametro esterno e lo spessore della parete 0,225 mm) riempiti con una soluzione intracellulare composta da (in mm) 125 K-gluconato, 10 KCl, 0,5 EGTA, 10 HEPES, titolato a pH 7.4 con KOH (dando una resistenza pipetta di circa 5 MΩ). Da notare che altre condizioni sperimentali come voltage-clamp registrazione richiedono una soluzione diversa. Se le iniezioni sono colorante desiderata, aggiungere una sonda fluorescente (usiamo 10 mM Alexa Fluor 594) o di una molecola tracciante (3% Neurobiotin). Inserire la micropipetta nel supporto e assicurarsi che l'elettrodo di riferimento (filo d'argento clorurati) è in contatto con la soluzione extracellulare nella camera di registrazione. Applicare una pressione al micropipetta e bersagliare un GFP che esprimono cellulare (usiamo un duplice obiettivo 40-immersione in acqua; NA 1,25). Amacrine corpi cellulari si trovano nello strato delle cellule gangliari (direttamente sotto la superficie con l'orientamento attuale della retina), così come nella parte prossimale dello strato nucleare interno (circa 55-75 micron nelle profondità della preparazione). Prima micropipetta contatto con la cellula bersaglio, la membrana limitante interna (una guaina fatta di gliali endfeet) alla retinasuperficie deve essere penetrato. Penetrazione di successo è riconosciuto da soluzione intracellulare che viene cacciato dalla punta micropipetta e stacca la membrana limitante interna dal tessuto di fondo della retina come si può osservare su un'immagine trasmissione a infrarossi catturata dalla IR-CCD. Approccio alla cella desiderata mettendo a confronto la posizione soma dei due fotoni immagine con l'immagine della IR-CCD che mostra la posizione della micropipetta registrazione. Si noti che questo passaggio non è facile da realizzare e richiede una certa pratica, perché la GFP-esprimere la cella deve essere riconosciuto nell'immagine trasmissione a infrarossi al fine di indirizzare la micropipetta verso di esso. Targeting corretto si ottiene quando la punta micropipetta cause fossette della superficie cellulare che può essere visto in due fotoni immagine. Alternativa a questa procedura, utilizzare un colorante fluorescente (per esempio Alexa Fluor 594, 100 mM) nella soluzione intracellulare per rivelare la posizione micropipetta in due fotoni immagine. Eccitazione a due fotoni a raggi infrarossi permette di fluorescenza del colorante sufficiente per rendere la micropipetta discernibile. A tal fine, regolare il campo di rilevamento del software di scansione laser per coprire anche fluorescenza rossa. Scaricare la pressione dalla micropipetta e ottenere un whole-cell patch-clamp in configurazione current-clamp mode. Una registrazione utilizzabile dovrebbe dare un potenziale di membrana di -50 a -55 mV e durare almeno 20 minuti. Presente stimoli visivi creati da un software stimolazione (usiamo QDS da Thomas Eulero, Università di Tubinga, Germania) 11 sul monitor del computer. Regolare la posizione spaziale della stimolazione ad essere centrato sulla cella registrato: Segnare la posizione delle cellule sul monitor che mostra l'immagine di trasmissione del IR-CCD e il centro un luogo-come stimolo su di esso. Regolare l'intensità dello stimolo con l'inserimento di filtri a densità neutra nel percorso del fascio. Per la calibrazione dello spettro di monitorare e vedere l'intensità Ref. [14]. Scegli un prolonged interstimulus intervallo (ad esempio, 15 s) per evitare di adattamento. Includere un fotodiodo sul percorso del raggio di tenere traccia dei tempi stimolo. Avviare il protocollo di stimolazione e registrare le risposte luce (si usa una frequenza di campionamento di 10 kHz, con filtraggio a 5 kHz per non spiking cellule; per la registrazione di picco di una frequenza di campionamento più alto come 20 kHz è consigliato). Utilizzare il software leggero stimolo per attivare il software di registrazione. Per tingere il riempimento lasciare che la diffusa fluorescente agente nella cella registrato per 30-45 minuti prima con attenzione ritraendo la micropipetta dalla cella. Fare attenzione a non estrarre il corpo cellulare. Se il non-tracciante fluorescente Neurobiotin è stato utilizzato, ha bisogno di visualizzazione legandosi a streptavidina coniugato con un fluoroforo (usiamo streptavidina Cy3, 1:400 per tutta la notte a 4 ° C dopo 20 min paraformaldeide fissazione della retina, per tingere accoppiamento Gli studi di incubazione streptavidina può essere prolungata fino a 3 d). In alternativa, le iniezioni possono essere eseguite anche conelettrodi forte (> 100 MW), quando il colorante è guidato iontophoretically nella cella impalato (impulsi rettangolari: 0,25-1 nA, 100 ms, intervallo di 100 ms, tempo totale 3-6 minuti). 3. Rappresentante dei risultati: I seguenti risultati provengono da uno studio su un topo che esprimono la proteina fluorescente verde (GFP) sotto il promotore per la tirosina idrossilasi 13,14, l'enzima che catalizza il fattore limitante nella sintesi delle catecolamine (TH:: GFP mouse). In base alla luminosità della GFP-segnale due distinte popolazioni cellulari si distinguono (Figura 2A). Cellule che esprimono il livello più alto GFP possiedono corpi cellulari situati nello strato nucleare interno (INL, figura 2A) o spostato nello strato delle cellule gangliari (GCL, Figura 2B) e stratificare nel mezzo dello strato interno plessiforme (IPL, Figura 2C) . Essi sono stati identificati come cellule di tipo 2 14-16 e potrebbe essere studiati sistematicamente in relazione alla morfologia (Figura 3) ed eleggereattività rical (Figura 4), ​​anche se la sua densità di popolazione ammonta solo a 250 cellule / mm 2. Figura 1. Rappresentazione schematica del setup sperimentale. Eccitazione a due fotoni (luce rossa percorso punteggiato) di fluoroforo che esprimono le cellule della retina intatta consente visivo mira da una micropipetta (percorso verde emissione di luce). La retina è sottoposta a stimoli ottici proiettata attraverso il condensatore del microscopio (percorso giallo chiaro), e le risposte cellulari leggeri vengono registrati. Figura 2. GFP-cellule che esprimono in un flatmount della retina di un TH:: mouse GFP. Due popolazioni si distingue per la luminosità del GFP-segnale: di tipo 1 le cellule (cellule DA) situato nel INL mostrando fluorescenza debole (A, vedi frecce) e il tipo intensamente etichettati 2 cellecon i corpi cellulari sia nel INL (A, vedi frecce) o sfollati nella GCL (B) e una stratificazione dendritica nello strato S3 della IPL (C). Barre di scala, 50 micron. Figura 3. Morfologia di una cellula di tipo 2 iniettato il tracciante Neurobiotin. Il tracciante è stata successivamente visualizzati con streptavidina Cy3-binding (magenta). Il microscopio, che è anche il segnale che raffigura GFP (verde), è una proiezione di pile immagine che copre il GCL e IPL. Scala bar, 50 micron. Figura 4. Risposte luce di una cellula di tipo 2 si trova nella GCL. Risposta modello da luce bianca a pieno campo illuminazione di intensità crescente nella gamma scotopica. Intensità dello stimolo è dato in photoisomerizations per asta al secondo (Rh * / asta / s). Uno stimolo prolungato di 3 s è stato usato per una migliore distinteione dei componenti risposta all'esordio stimolo (ON risposta) e offset (OFF risposta).