Электрофизиологические характеристика GFP-выражая клеточных популяций в Неповрежденный Retina

Следующее описание предполагает, что экспериментатор имеет общее представление о структуре сетчатки, патч-зажим записи и двухфотонной микроскопии. Полезные сведения по созданию и организации работы патч-зажим установки и двухфотонного изображения системы см. [7-12]. 1. Животные и подготовки ткани Держите мышь темно-адаптирован для не менее 3 ч. В то же время, подготовить 1-2 л внеклеточный раствор, состоящий из (в мм) 125 NaCl, 2,5 KCl, CaCl 1 2, 1.6 2 MgCl, 25 NaHCO 3, 10 D-глюкозы и уравновешивать его рН 7,4 от отравления газом с карбогена (5% СО 2 в O 2) при комнатной температуре. Эвтаназии мыши в герметичных камер СО 2 передозировки следует шейки дислокации. Эта процедура и следующие шаги должны быть выполнены в темноте. Используйте тусклый длинноволновом освещении (мы блокируем коротких длин волн от холодного источника света 690 нм-longpasс фильтром) для поддержки личного видения, сохраняя при этом глаза животного темно-адаптированные (мыши есть только плохое зрение в красную часть спектра света). Для работы в полной темноте использовать инфракрасную подсветку (> 800 нм) и носить очки ночного видения. Выявлять глаза с парой изогнутых ножниц радужной оболочки и передавать их на блюдо внеклеточной решение под рассекает микроскопом. Удалить роговицы и ресничного тела, открыв глаза лампы вдоль Serrata ора (граница между сетчаткой и цилиарного тела) с парой весной ножницы (сначала с помощью ланцета пробить отправной точкой для резки). Выньте линзы и аккуратно отделить сетчатку от пигментного эпителия. Если ориентация сетчатка имеет решающее значение для вашего исследования, указывают на то, как в работе [12]. Вырезать зрительного нерва между сетчаткой и пигментным эпителием и удалить сетчатку от наглазник. Обратите внимание на направление сетчатки поверхности: внутри свернувшейся сетчатки ganglионной ячейки стороны; снаружи фоторецепторов стороны. Удалить из стекловидного внутренней поверхности сетчатки, осторожно потянув его с помощью деревянной зубочистки. Для этой цели использовать небольшой объем внеклеточной решение, которое охватывает только сетчатки. Стекловидного прилипает к зубочистку и можно перетаскивать центробежно от сетчатки. Затем, нанесите короткими разрезами вдоль сетчатки периметру для облегчения уплощение тканей. Передача сетчатки в записи камеры фоторецепторов стороной вниз, распространение его на стеклянным дном (мы используем тонкой кистью) и обездвижить его с нейлоновыми нанизаны рама из нержавеющей стали. Подготовка второго сетчатки таким же образом, и держать его темно-адаптирована в carboxygenated внеклеточный раствор для последующего использования. 2. Записи Установить записи камеры в темноте под вертикальном лазерного сканирующего микроскопа и переливать сетчатки подготовки постоянно (не менее 5 мл / мип) с carboxygenated внеклеточный раствор нагревают до 35 ° C. Микроскопа (также оснащен инфракрасным чувствительных ПЗС-камеры) расположен на амортизирующих воздушных таблицы внутри клетки Фарадея для электронного экранирования. Обложка клетку с непрозрачным занавесом держать подготовку в темноте. Мы также экран выключен свет от компьютерных мониторов красной прозрачной пленкой. Tune инфракрасного лазера 850-870 нм или более длинных волнах, переключиться в режим синхронизации состояния и использования двухфотонного возбуждения для визуализации GFP-экспрессирующие клетки. Ослабления излучения лазера использованием фильтры нейтральной плотности контролируется программное обеспечение лазерного сканирования до такой степени, что как раз достаточна для четкого признания флуоресцентные ячейки Для патч-зажим записей в текущей зажим режиме микропипетки использовать стекло (мы используем трубы из боросиликатного стекла 1,5 мм и наружным диаметром 0,225 мм, толщина стенки), заполненной внутриклеточного раствора, состоящего из (в мм) 125 К-глюконат, 10 KCl, 0,5 EGT, 10 HEPES, титруют до рН 7,4 с КОН (предоставление пипетки сопротивление около 5 МОм). Обратите внимание, что другие экспериментальные условия, такие как напряжения зажим записи требуется другое решение. Если краситель инъекции желании, добавить флуоресцентного зонда (мы используем 10 мМ Alexa Fluor 594) или молекула примеси (3% Neurobiotin). Вставьте микропипетки в держатель и убедитесь, что электрод сравнения (хлорированная серебряной проволоки) находится в контакте с внеклеточной решение в записи камеры. Надавите на микропипетки и целевых GFP-экспрессирующих клетки (мы используем 40-кратного погружения в воду цели; NA 1.25). Amacrine органы ячейки расположены в слое ганглиозных клеток (непосредственно под поверхностью в текущей ориентации сетчатки), а также в проксимальной части внутреннего ядерного слоя (около 55-75 мкм глубоко в стадии подготовки). Перед микропипетки контакт с целевой ячейки, внутренняя пограничная мембрана (оболочка из глиальных endfeet) на сетчатке глазаПоверхность должна быть проникли. Успешное проникновение признан внутриклеточных решение, которое выносится от кончика микропипетки и отделяет внутреннюю пограничная мембрана из основной ткани сетчатки, как можно наблюдать на инфракрасном изображении передачи захваченных ИК-ПЗС-камеры. Подход нужную ячейку, сравнивая положение сома из двухфотонного изображение с картиной ИК-ПЗС-камеры, показывающие расположение записи микропипетки. Обратите внимание, что этот шаг не легко достигается и требует некоторой практики, потому что GFP-экспрессирующих клетка должна быть признана в инфракрасной передачи изображения того, чтобы направить микропипетки к нему. Правильная ориентация достигается тогда, когда кончик микропипетки причины рябь на поверхности клеток, которые можно увидеть в двухфотонного изображения. Альтернативой этой процедуре использования флуоресцентного красителя (например, Alexa Fluor 594, 100 мкМ) в внутриклеточных решение раскрыть микропипетки позиции в двухфотонного изображения. Двухфотонного возбуждения инфракрасной обеспечивает достаточную флуоресценции этого красителя, чтобы сделать микропипетки заметны. Для этой цели, корректировать дальность обнаружения в программном обеспечении лазерного сканирования для покрытия также красной флуоресценции. Сбросьте давление из микропипетки и получить цельноклеточная патч-зажим конфигурации в текущем зажим режиме. Использовать записи должны дать мембранного потенциала от -50 до -55 мВ и длиться не менее 20 мин. Настоящий визуальные стимулы созданы стимуляции программного обеспечения (мы используем QDS Томасом Эйлера, Университет Тюбингена, Германия) 11 о мониторе компьютера. Отрегулируйте пространственного положения стимуляции быть сосредоточены на ячейке записано: Марк ячейки позиции на мониторе показывает передачи изображения ИК-ПЗС-камерой и центром спот-как стимул на него. Tune интенсивности раздражения, вставив фильтры нейтральной плотности на пути луча. Для калибровки монитора спектр и интенсивность см. [14]. Выберите пролонгироватьг interstimulus интервал (например, 15 сек), чтобы избежать адаптации. Включите фотодиод в пути луча, чтобы вести учет времени стимула. Начало стимуляции протокол и запись свет ответы (мы используем частоту дискретизации 10 кГц с фильтрацией на уровне 5 кГц для не-пики клеток; для записи шип высокая частота дискретизации 20 кГц, как это рекомендуется). Использование программного обеспечения стимуляции светом для запуска программного обеспечения для записи. Для заполнения красителя позволяют флуоресцентные диффузного вещества в ячейке записан в течение 30-45 мин до тщательно втягивания микропипетки из клетки. Будьте осторожны, не вытащить тело клетки. Если не-люминесцентные трассирующими Neurobiotin был использован, он должен визуализации путем связывания со стрептавидином конъюгированных с флуорофора (мы используем стрептавидином Cy3, 1:400 в течение ночи при 4 ° С через 20 мин параформальдегида фиксации сетчатки; на красителях связи Исследования стрептавидин инкубации может быть продлен до 3 г). Кроме того, инъекции могут быть выполнены срезкое электродов (> 100 МОм), когда краситель приводится iontophoretically в пронзил клетки (прямоугольных импульсов: 0.25-1 нА, 100 мс, интервал 100 мс, общее время 3-6 мин). 3. Представитель Результаты: Следующие результаты исходят из исследования мыши выразив зеленый флуоресцентный белок (GFP) под промотор для тирозингидроксилазы 13,14, фермент, катализирующий ограничение скорости шаг в синтезе катехоламинов (TH:: GFP мыши). На основании яркости GFP-сигнал двух различных клеточных популяций различимы (рис. 2A). Клетки, экспрессирующие GFP выше уровня обладают клеточных тел расположенный во внутреннем ядерном слое (INL, рисунок 2А) или перемещенных в слое ганглиозных клеток (ГКЛ, рисунок 2B) и стратификации в середине внутреннего слоя плексиформные (IPL, рисунок 2C) . Они были определены в качестве 2-го типа клетки 14-16 и может систематически изучать по отношению к морфологии (рис. 3) и избратьrical активности (рис. 4), хотя его плотность населения составляет лишь 250 клеток / мм 2. Рисунок 1. Схематическое изображение экспериментальной установки. Двухфотонного возбуждения (красная пунктирная путь света) флуорофора-экспрессирующих клеток в сетчатке нетронутыми позволяет визуальной ориентации по микропипетки (зеленого свечения путь). Сетчатки подвергается оптические раздражители проецируется через конденсатор микроскопа (желтый путь света), и клеточные ответы света записываются. Рисунок 2. GFP-экспрессирующие клетки в сетчатке глаза flatmount из TH:: GFP мыши. Две популяции можно отличить по яркости GFP-сигнала: 1-го типа клеток (клетки Д. А.), расположенный в INL показывает слабую флуоресценцию (см. стрелки) и интенсивно помечены 2 типа клеткис клеточными органов либо в INL (см. стрелки) или перемещенных в ГКЛ (В) и дендритных стратификации в слое S3 в IPL (С). Шкала баров, 50 мкм. Рисунок 3. Морфология 2-го типа клетка вводили трассирующими Neurobiotin. Трассирующими был впоследствии визуализируется стрептавидином Cy3 связывания (пурпурный). Микрофотографии, который также является изображением сигнала GFP (зеленый), является проекцией изображения стеки покрытие GCL и IPL. Шкала бар, 50 мкм. Рисунок 4. Свет ответы 2-го типа клетка находится в GCL. Ответ шаблон белый свет всего месторождения освещения увеличением интенсивности в скотопическое диапазона. Стимул интенсивности дается в photoisomerizations на стержне в секунду (Rh * / стержень / с). Длительном стимулом 3 сек была использована для улучшения различныхионной компоненты в ответ начала стимула (ON ответ) и смещения (OFF ответ).