1. Microchip изготовления SU8 мастер изготовления. Для получения микрофлюидных каналов 40 мкм высоты, спина пальто SU8-50 (MicroChem корпорации) на пластине кремния при 3000 оборотов в минуту в течение 30 сек Мягкие выпекать на горячей пластине при температуре 65 ° С в течение 5 минут и 95 ° С в течение 30 минут для испарения растворителя и уплотняют пленку. После охлаждения, подвергать SU8 сопротивляться 360-440 нм излучения 300 мДж / 2 под соответствующую маску. После экспозиции, выпекать пластины при температуре 65 ° С в течение 2 минут и 95 ° С в течение 4 минут. После охлаждения, развивать неэкспонированные области (Micrpoposit ЕС растворителя, Chestech) в течение 5 минут, помешивая. 5 Используйте свежие ЕС растворителя для промывки пластины, а затем высушить его под газ генерировать чистую поверхность. Лечить пластины с гексаном и метанола стирок. Полное SU8 мастер производственного процесса с заключительный этап испарения трихлор (1,1,2,2-perfluoocytl) силана на поверхности (в эксикаторе в течение 40 минут). PDMS curinг, игра в кости и перфорирования. Для формирования структурированных микрофлюидных субстраты, мы смешиваем Sylgard 184 (Dow Corning) в 10:01 (в / в) соотношение смолы сшивателя, а затем залить мастера. Дега в эксикаторе, а затем вылечить устройство (верхний слой) в течение одного часа при температуре 65 ° C. Вырезать вылечить PDMS и очистить его от хозяина. Создать доступ отверстия для жидкостного трубы использованием биопсии удар. Cure еще один слой PDMS (8 г смолы равномерно распределены в 10×10 см блюдо Петри) в течение 20 минут при температуре 65 ° C. Место подготовлено верхнего слоя на нижний слой, а затем лечение в течение ночи при 65 ° C. Пил чипов от чашки Петри и кости для использования. 2. Экспериментальная установка Микрофлюидных установки Заполните шприцы (пластик или стекло из Бектон, Дикинсон и компания или SGE Аналитические науки) с необходимыми решениями, гарантируя, что ни пузырьков воздуха остается в какой-либо части трубы. Для генерации капель два этапа используются. Водный (разгон) ПГАэлектронной содержит реагенты интереса (например суспензию клеток в питательной среде, или решение молекулярной флуорофоров). Масляной фазы, которая в данном случае выступает в качестве непрерывной фазы, как правило, образуется из смеси масла и поверхностно-активных веществ, например, 2% Raindance ПАВ (Raindance технологий) в фторированные масла (3M Fluorinert Электронные Жидкие FC-40), или 2% Span 80 (Croda) в минеральном масле. Fit трубки (Полиэтиленовая трубка, Гарвардский аппарата) того же внутреннего диаметра, как иглу шприца советы по одним концом к игл. Трубы должны быть сокращены на кратчайшее расстояние, чтобы минимизировать поток неустойчивости из-за колебательных возмущений. Подключите другие концы трубки прямо на отверстия, пробитые в субстрат PDMS. Более сложные решения, такие как использование кварцевую капиллярную портов и разъемов (например, Upchurch Nanoports) также может быть реализован для более надежного взаимодействия между микрофлюидных устройства и трубы. Подключите выходпорт чипа трубы и направить в коллектор (для сбора отходов или дальнейшей обработки аналита). Горы шприцев на шприцевой насос (например, PHD 4400 Hpsi программируемые насосы шприц, Гарвардский аппарата) и определить желаемую вливая расхода по каждой фазе (как правило, на порядок микролитров в минуту). Минимальное соотношение масло / водных системах, работающих с 1 рекомендуется, чтобы избежать увлажнения PDMS от водной фазы, что может привести к нестабильной образование капель (в зависимости от устройства геометрии). По той же причине, также рекомендуется в первую очередь промыть масляную фазу только через любой микрофлюидных каналов, до введения в водную фазу. Окончательно установка для экспериментов здесь показан на рисунке 2а. Оптический настройки системы Для зонда небольших объемах (до нескольких пиколитра) в микрофлюидных каналов с высоким пространственным и временным разрешением использования конфокальной микроскопии (с автоматомред субмикронных позиционирования потенциала). Использование водорастворимых флуоресцентных молекул с идеально высокие урожаи квант. Excite молекул с помощью лазера, работающего на длине волны, которая соответствует поглощению флуорофора участие. Например, общие флуоресцентные молекулы, такие как флуоресцеин 5-изотиоцианат (FITC) и Alexa Fluor-488 может быть эффективно возбуждается использованием 488 нм лазерный диод (например PicoQuant Gmbh, ЛДГ-PC-485). Флуоресцентные молекулы, такие как Техас Красный или Allophycocyanin (APC) может быть эффективно закрыта на 633 нм, используя He / Ne лазера (например, Ньюпорт Р-31425). Использование импульсных лазеров, работающих на частотах повторения нескольких МГц (с несколькими разделения импульсов нс) и флуорофоров с достаточно дифференцированной жизни свойства флуоресценции Активность: (FLIM) экспериментов. Использование пучка рулевого зеркал и оптики для управления пучком высоте, а также направления пучка. Используйте дихроичных зеркало для отражения лазерного луча на цель лENS. Если два лазеры используются одновременно, двухдиапазонные дихроичных зеркал может быть установлен, чтобы отражение двух лучей лазера (например, для 488 и 633 нм пучки z488/633rdc зеркало из Chroma корпорации Технология идеально подходит). Используйте бесконечности коррекцией, высокий числовой апертурой (NA) объектива микроскопа (т.е. Olympus 60 х / 1,2 Н.А., погружения в воду), чтобы лазерный луч, чтобы плотно фокус в микрофлюидных канала. При работе с высокими микроканалов (> 100 мкм) цели использовались должна быть соответствующим образом выбраны для обеспечения того, чтобы его рабочее расстояние эффективно покрывает всю высоту микроканальных. Сбор флуоресценции, испускаемых образцом (в пределах микрофлюидных канал) с использованием тех же высоких целей Н.А. и передаются через тот же дихроичных зеркал. Удалите любые остаточные возбуждении светом с помощью одного или двух диапазонах излучения фильтром (например, z488/633 фильтр Chroma Technology Corporation). Фокус флуоресценции emissioп на 75 мкм обскуры использовании плоско-выпуклой линзы (например, 50,2 F, Ньюпорт Ltd.) Расположите отверстие в конфокальной плоскости объектива микроскопа. Используйте другой дихроичных зеркал (например 630dcxr, Chroma Technology Corporation), чтобы разделить флуоресцентного сигнала на двух детекторов. Фильтры флуоресценции отражается дихроичных зеркал с фильтром выбросов (например, hq540/80 м фильтр Chroma Technology Corporation) и сфокусировать его с плоско-выпуклой линзы (например, F = 30,0, 25,4 мм идентификатор, Thorlabs) на первом ( «зеленых») детектором. Для экспериментов с участием вторичных красный флуорофора фильтр флуоресценции передается дихроичных зеркал с другим выбросов фильтр (например, hq640lp фильтр Chroma Technology Corporation), а затем сфокусировать его с другим плоско-выпуклой линзы на второй ("красный") детектором. Используйте лавинных фотодиодов (например AQR-141, EG & G, Perkin-Elmer) для обнаружения фотонов флуоресценции. Окончательный установки показана на <strОнг> Рисунок 2б. 3. Капли поколения и сбора данных Методы капли поколения Вы можете использовать два основных конфигураций микроканалов для создания капель: поток фокусировки или Т-образного перекрестка формате (рис. 3а и 3б) 6,7 Оба метода эквивалентны тех пор, пока капли образуются так велик, как микроканальных себя.. В результате сдвига силы, возникающие от использования этих геометрий принести двух несмешивающихся жидкостей вместе и последующей капиллярной неустойчивости, которые развиваются в интерфейс, монодисперсных капель (размером до нескольких femtoliters) генерируются спонтанно. Вы можете инкапсулировать реагентов по-разному: реагенты могут быть подготовлены и смешанные с чипом к желаемой смеси / концентрации, или они могут быть приведены отдельно в чип, а затем соединяются вместе до образования капель (рис. 3в). ЭтоПоследний метод обеспечивает более высокую гибкость, так как смеси / концентрации могут быть изменены просто настройке относительной скорости потока. Следует отметить, что для сотовых инкапсуляции, клеточной суспензии в шприц следует перемешать, чтобы избежать конденсации клеток в течение сроков эксперимента. Флуоресценция сбора данных. Пару электронный сигнал от детектора лавинный фотодиод (описано в 2.2.12) для многофункционального устройства сбора данных для регистрации данных (например, PCI-6602, компания National Instruments), работает на персональном компьютере. Для FLIM эксперименты подключения детекторов с корреляцией по времени Одноместный счета фотонов (TCSPC) карты (например, TimeHarp 100, PicoQuant GmbH), работающим на отдельных ПК. Эта карта позволяет флуоресценции данных жизнь, чтобы быть получена с помощью TCSPC методологии: каждого зарегистрированного флуоресцентного фотона коррелируется с лазерным импульсом инцидента, и поэтому каждый фотон испускается флуоресцентной назначается время задержки. Эти данныемогут быть установлены на одном или нескольких экспоненциальной кривой распада для получения оценки флуорофора / с радиационным коэффициент цена / s. Deconvolute исходных данных с помощью функции инструмента ответа (IRF) детектора: это получается с помощью низкой концентрации аурамин-O решение (которое обнаруживает жизни флуоресценции в несколько пикосекунд) 8. 4. Признание сотовых и картирование смешивания в каплях Признание сотовых и картирование смешивания в каплях Использование кишечной палочки Топ-10 штамма для эксперимента анализа жизнеспособности. Культуры клеток в Лурия-Бертани бульона на ночь и соответствуют оптической плотностью до 0,5 до экспериментов. Используйте 0,4 мкМ SYTO9 и 1 мкМ пропидий йодида для определения жизнеспособности клеток. Оба являются ДНК-интеркалирующих красителей и их интенсивность флуоресценции увеличивается более чем на 20 складок при связывании с ДНК. SYTO9 является зеленый флуоресцентный краситель, который мнеmbrane проницаемыми и пропидий йодистого красный флуоресцентный краситель, который является мембрана непроницаема. Таким образом живые клетки светиться "зеленых" в то время как мертвые клетки выставку как «зеленые» и «красный» выбросов. Использование установки введены в 2.2) для зеленой / красной флуоресценции обнаружения. Использование портативных мини-магнитной мешалкой (штат Юта Биодизель питания, штат Юта), чтобы вызвать клеточные суспензии, в течение 3 мл шприца BD Plastipak оснащены 7 мм магнитной мешалкой, чтобы предотвратить ячейки седиментации. Картирование смешивание события с помощью FLIM Фокус оптический датчик объема на половине высоты микроканальных, по которым текут капли. Форма капли из двух водных растворов (как показано на рисунке 3, в), каждый из которых (невзаимодействующих) флуорофора с различными характерными флуоресцентные жизни. Начиная с одной стороны канал, выполняют каждый эксперимент по всей ширине канала с интервалом в 1 мкм. Ред каналГЭС могут быть легко идентифицированы как интенсивность флуоресценции резко падает один раз лазерный луч фокусируется в их близости. Реализация алгоритма отличить сигнал всплесков (связанные с каплями) от фонового шума из масляной фазы и установить продолжительность каждой вспышки. Реализация второй алгоритм извлечения временной задержки и интенсивности значения вдоль длины каждой капли в определенной ширины, где эксперимент был проведен 9. Затем с помощью оценки максимального правдоподобия (ОМП) алгоритм для оценки времени жизни флуоресценции для каждой капли в эксперименте. 8 Усреднение жизни значения для всех капель в эксперименте, уменьшает окончательный ошибка ОМП расчета (более капель исследовали, меньше ошибок). После жизни траектории было получено для каждой ширины, сочетают в себе все траектории в 2D-карте. Так как каждый ценности жизненного цикла связано с частЛар смесь двух флуорофоров, концентрация (или смешивания) карта может быть получена таким образом. При желании 3D-карта капли смешивания могут быть легко получены путем повторения этого протокола в различных положениях по высоте микрофлюидных канала. 5. Анализ данных Интерпретировать экспериментальные сырых файлов данных на соответствующий язык вычислительных, так что они могут быть предметом дальнейшего анализа (например, текстовые файлы, которые содержат изменения фотоотсчетов с течением времени, могут быть легко извлечены в Matlab для обработки и анализа данных). Возможно, вам придется писать специальные коды для доступа к данным, содержащимся в файлах более сложных экспериментов (например, для FLIM) или для запуска алгоритмов ОМП или строить 2D-карты смешивания скороговорки из жизни траекторий. 6. Представитель Результаты Сотовые признание Типичными примерами уагiation фотоотсчетов как функция времени для клеточных экспериментов показаны на рисунках 4a и с, в течение двух сотен миллисекунд. Важно Лурия-Бертани бульон (LB среде) выступает как слабо флуоресцирующих фоне определяющих границы водной капли, в то время как отдельный фотон всплески, соответствующие наличию отдельных клеток, могут быть выделены на вершине этого фона. Л. Б. флуоресцентные фон характеризуется примерно прямоугольного сечения (отмечены красным и зеленым пунктиром). Максимуму полуширина (FWHM) флуоресцентных всплески, связанные с E. кишечной клетки в 30 раз короче, чем фон капли событий, что согласуется с относительной длины капли (40 микрон, что соответствует объемом 30 пиколитрах) и Е. кишечной клетки (1.5-2.0 мкм). 10 С двухканальной обнаруживатьионной системы, существование живых клеток или мертвые клетки можно отличить от анализа зеленого и красного каналов. рисунках 4 б, г показывают, описывающие распределение вероятностей число клеток в капле. Картирование смешивание события с помощью FLIM Молекулярной жизни флуоресценции внутреннее свойство отдельных флуорофора, что влияет только его химический окружающей среды. Соответственно его измерения могут быть использованы для получения информации об окружающей среде (например, рН раствора, температуры, полярности и вязкости) с превосходным разрешением и точностью, чем время интегрированные флуоресцентных измерений, которые зависят от экспериментальных факторов (таких, как концентрация, интенсивность возбуждения и оптические коллекции эффективности). 9,11 Как показано в другом месте, 8 можно карту смешивания моделей внутри капли с помощью двух флуорофоров с диfferent значения жизни. В смесь, содержащую два (невзаимодействующих) люминесцентные видов распада возьмет на биэкспоненциальной форме, как это показано в уравнении 1: Индивидуальный жизни определяются как τ1 и τ2, и амплитуда каждого компонента дается α1 и α2 соответственно. Средний срок службы может быть определена следующим образом: Где β1 и β2 являются долю каждого компонента и определяются следующим образом: С датчиком объема является фиксированной и капли текут по этой позиции, траектория жизни значения по длине капель в этом конкретном ширина может быть при этом получается. Характеристической траектории для определенной ширины, усреднениеред среди 6000 капель, можно наблюдать на рисунке 5а. Объединение траектории по всей ширине канала приводит к образованию 2D концентрации (или смешивания) карте. Типичный результат представлен на рисунке 5б. При усреднении результатов среди большого количества капель, стандартная ошибка Полученные результаты могут быть значительно сокращены (1% от стандартной ошибки с 95% доверительный интервал для рис. 5а). Метод определения времени жизни траектория предполагает, что все капли практически одинаковы. Это подтверждается, в значительной степени правильным по двум основным причинам: если капли значительно отличались, усредненные траектории жизни получили бы льстить, менее расходящиеся профилей (и резких различий в жизни по длине усредненные капли последовательно обнаружено). Кроме того, результаты воспроизводимы независимо от отдельныхкапель проанализировать или количество капель, используемых в расчетах 8. Рисунок 1. Процесс потока на микрофлюидных изготовления чипов. Рисунок 2) Диаграмма представляющих шприцевые насосы и шприцы, подключенных к микрофлюидных чип для образования капель, б) Схематическое изображение типичной оптической установки для двух лазерных – два флуорофора (зеленый и красный) возбуждения и регистрации.. DC = дихроичным зеркалом, EM = выбросов фильтр, L = объектива, PH = Пинхол, APD = лавинный фотодиод детектора. Рисунок 3 На-чип капли формирование стратегии: а) поток фокусировки конфигурации, б) Т-образном перекрестке конфигурации.. в) На чипе инкапсуляции в ДРoplets двух первоначально отдельных водных реагентов. Рисунок 4 Оптический считывания 0,2 с следы записаны для (а) мертвым и (в) живые клетки (расход для клеточной суспензии: 1 мкл мин -1, масло: 2 мкл мин -1).. Каждый арочной сигнала соответствует слабо люминесцентные ЛБ среда, которая формирует водные капли, капли с границами, отмеченные пунктирными линиями. Зеленые сигналы представляют считывания при 633 нм и красный сигналы на длинах волн 633 нм. Клетки отличаются вертикальной шип, связанных с ДНК интеркалирующих красителей. Распределение вероятностей для сотовых занятости в рамках единой капли для (б) мертвых клеток и (г) живые клетки. Рисунок 5) Типичные траектории усредненной жизни по длине капли в определенной ширины;. Б)Типичное представление сочетание всех усредненной траектории исследовал вдоль всей ширине капель в 2D жизни (или концентрация, выраженная в% FITC /% Str-AF488) карте.
