1. Microchip Herstellung SU8 Meister Fertigung. Um mikrofluidischen Kanälen von 40 um Höhe, Spin Mantel SU8-50 (MicroChem Corp) auf einem Si-Wafer bei 3000 rpm für 30 s erhalten Weiche backen auf einer Heizplatte bei 65 ° C für 5 Minuten und 95 ° C für 30 Minuten bis das Lösungsmittel verdampft und verdichten den Film. Nach dem Abkühlen aussetzen SU8 mit 360-440 nm Strahlung widerstehen bei 300 mJ / 2 unter der entsprechenden Maske. Nach der Belichtung der Wafer backen bei 65 ° C für 2 Minuten und 95 ° C für 4 Minuten. Nach dem Abkühlen zu entwickeln die nicht belichteten Bereiche (Micrpoposit EC Lösungsmittel, Chestech) für 5 Minuten unter Rühren. 5 Verwenden Sie frische EC Lösungsmittel auf den Wafer spülen und trocknen es unter Gas, um eine saubere Oberfläche zu erzeugen. Behandeln Sie die Wafer mit Hexan und Methanol wäscht. Füllen Sie das SU8 Master Fertigungsprozess mit einem abschließenden Schritt des Verdampfens Trichlor (1,1,2,2-perfluoocytl) silan auf die Oberfläche (in einem Exsikkator für 40 Minuten). PDMS Curing, Würfel und Lochen. Zur Bildung strukturierte mikrofluidischen Substraten, mischen wir Sylgard 184 (Dow Corning) in einem 10:1 (w / w) Verhältnis von Harz zu Vernetzer und gießen Sie dann über den Master. Degas in einem Exsikkator, und dann zu heilen das Gerät (obere Schicht) für eine Stunde bei 65 ° C. Cut ausgehärteten PDMS und diese abziehen den Meister. Create Zugang Löcher für fluidische Schlauch mit einer Biopsie Punch. Cure eine weitere Schicht von PDMS (8 g des Harzes gleichmäßig in einem 10×10 cm Petrischale verteilt) für 20 Minuten bei 65 ° C. Legen Sie die vorbereiteten oberste Schicht auf der unteren Ebene und dann Heilung über Nacht bei 65 ° C. Schälen Sie die Chips aus der Petrischale und in Würfel schneiden für den Einsatz. 2. Versuchsaufbau Mikrofluidik-Setup Fill-Spritzen (Kunststoff oder Glas von Beckton, Dickinson and Company oder von SGE Analytical Science) mit der erforderlichen Lösungen, wodurch sich keine Luftblasen bleiben in alle Teile des Schlauchs. Für Tröpfchenerzeugung zwei Phasen verwendet werden. Die wässrige (dispergiert) phase enthält die Reagenzien von Interesse (z. B. eine Suspension von Zellen in Wachstumsmedium, oder eine Lösung des molekularen Fluorophoren). Die Öl-Phase, die in diesem Fall als die kontinuierliche Phase, in der Regel aus einer Mischung von Öl und Tensid, z. B. 2% Raindance Tensid (RainDance Technologies) in fluorierten Öl (3M Fluorinert Elektronische Flüssigkeit FC-40) gebildet ist, oder 2% Span 80 (Croda) in Mineralöl. Fit Schlauch (Polyethylen-Schlauch, Harvard Apparatus) des gleichen Innendurchmesser wie die Nadel der Spritze Tipps an einem Ende an den Nadeln. Der Schlauch sollte auf die kürzest mögliche Länge zu Instabilitäten durch Schwingungs-Störungen zu minimieren geschnitten werden. Schließen Sie das andere Ende des Schlauches direkt in die Löcher in der PDMS-Substrat gestanzt. Komplexere Lösungen wie die Verwendung von Silica-Kapillare Ports und Steckverbindungen (zB Upchurch Nanoports) kann auch für eine robustere Schnittstelle zwischen der mikrofluidischen Vorrichtung und das Rohr eingeführt werden. Verbinden Sie den AusgangPort des Chips mit dem Schlauch und direkt in einen Sammler (für Müllabfuhr oder weitere Analyten Verarbeitung). Montieren Sie die Spritzen auf eine Spritzenpumpe (z. B. PHD 4400 HPSi programmierbare Spritzenpumpen, Harvard Apparatus) und definieren Sie den gewünschten Infusion flow-rate für jede Phase (in der Regel in der Größenordnung von Mikroliter pro Minute). Eine Mindestquote von Öl / wässrige Flussraten von 1 wird empfohlen, um die Benetzung des PDMS durch die wässrige Phase, die zu instabilen Tropfenbildung (je nach Gerät Geometrie) führen würde. Aus dem gleichen Grund ist es auch empfehlenswert, first flush der Ölphase allein durch jede mikrofluidischen Kanälen, vor der Einführung der wässrigen Phase. Die endgültige Setup für die Experimente hierin verwendet wird in Abbildung 2a dargestellt. Optical System-Setup Um kleine Mengen (bis auf wenige Picoliter) innerhalb der mikrofluidischen Kanälen mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung Sonde mit einem konfokalen Mikroskop (mit automated submicron Positionierung Kapazität). Verwenden Sie wasserlösliche fluoreszierende Moleküle mit ideal hohen Quantenausbeuten. Excite die Moleküle mit einem Laser bei einer Wellenlänge, die die Absorption des Fluorophors beteiligt übereinstimmt. Zum Beispiel können gemeinsame fluoreszierende Moleküle wie zum Beispiel Fluorescein 5-Isothiocyanat (FITC) und Alexa-Fluor 488 effizient angeregt werden mit einem 488 nm Diodenlaser (z. B. PicoQuant Gmbh, LDH-PC-485). Fluoreszierende Moleküle, wie Texas Red oder Allophycocyanin (APC) effizient bei 633 nm verlassen werden mit Hilfe eines He / Ne-Laser (zB Newport R-31425). Verwenden Sie gepulsten Lasern, die bei Repetitionsraten von mehreren MHz (mit mehreren ns Trennungen) und Fluorophoren mit ausreichend differenziert Lebensdauer Eigenschaften für Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM) Experimente. Verwenden beam-Kippspiegel und Optik, um den Strahl Höhe sowie Strahlrichtung zu kontrollieren. Verwenden Sie einen dichroitischen Spiegel den Laserstrahl in das Objektiv l reflektierenens. Wenn zwei Lasern gleichzeitig verwendet werden, kann ein Dual-Band dichroitischen Spiegel installiert, um Reflexion der beiden Laserstrahlen (zB für 488 und 633 nm Strahlen eine z488/633rdc Spiegel von Chroma Technology Corporation ist ideal) zu ermöglichen. Verwenden Sie ein Infinity-korrigiert, hoher numerischer Apertur (NA) Mikroskop-Objektiv (dh Olympus 60 x / 1,2 NA, Eintauchen in Wasser), um das Laserlicht zu einem engen Fokus innerhalb einer Frist von einem mikrofluidischen Kanal. Beim Arbeiten mit hohen Mikrokanäle (> 100 pm) das Ziel verwendet werden, müssen entsprechend ausgewählt werden, um sicherzustellen, dass seine Arbeitsabstand effektiv deckt die volle Höhe des Mikrokanals. Sammeln Fluoreszenz von der Probe (innerhalb der mikrofluidischen Kanal) mit dem gleichen hohen Ziel NA und übermittelt durch die gleiche dichroitischen Spiegel emittiert. Entfernen Sie alle verbleibenden Anregungslicht mit einem Single-oder Dual-Band-Emission-Filter (zB ein z488/633 Filter von Chroma Technology Corporation). Schwerpunkt der Fluoreszenz emission auf eine 75 um Pinhole mit einer plan-konvexen Linse (z. B. 50,2 F; Newport Ltd.) Position der Lochblende in der konfokalen Ebene des Mikroskop-Objektivs. Verwenden Sie einen anderen dichroitischen Spiegel (z. B. 630dcxr, Chroma Technology Corporation), um die Fluoreszenz-Signal auf zwei Detektoren aufgeteilt. Filter die Fluoreszenz durch den dichroitischen Spiegel mit einem Emissions-Filter (zB ein hq540/80 m-Filter von Chroma Technology Corporation) reflektiert und fokussieren es mit einer plan-konvexen Linse (zB f = 30,0, id 25,4 mm, Thorlabs) auf die erste ( 'green')-Detektor. Für Experimente mit einem sekundären roten Fluorophors Filter die Fluoreszenz durch den dichroitischen Spiegel mit einem anderen Emissions-Filter (zB ein hq640lp Filter von Chroma Technology Corporation) übertragen und dann konzentrieren sie mit einer anderen Plankonvexlinse auf den zweiten ('rot')-Detektor. Verwenden Sie Avalanche-Photodioden (zB AQR-141, EG & G, Perkin-Elmer) zur Detektion von Fluoreszenz-Photonen. Die letzte Einstellung ist in dargestellt <strong> Abbildung 2b. 3. Droplet Generation und Datenerfassung Droplet-Generation-Methoden Sie können im Wesentlichen zwei Konfigurationen von Mikrokanälen zu Tröpfchen zu erzeugen: eine Strömung Fokussierung oder T-Kreuzung-Format (Abbildung 3a und 3b) 6,7 Beide Methoden sind gleichwertig, solange die gebildeten Tröpfchen so breit wie die Mikrokanal selbst sind.. Als Folge der Scherkräfte, die durch Nutzung dieser Geometrien zu den beiden nicht mischbaren Flüssigkeiten zusammen zu bringen und die anschließende Kapillare Instabilitäten, die in der Schnittstelle zu entwickeln, monodisperse Tröpfchen (so klein wie ein paar Femtolitern) werden spontan generiert entstehen. Sie können Reagenzien auf unterschiedliche Weise zu kapseln: Reagenzien vorbereitet und Off-Chip gemischt werden, um die gewünschte Mischung / Konzentration, oder sie können separat in den Chip gebracht werden und dann gemeinsam vor der Tropfenbildung (Abbildung 3c) kombiniert. Dieserletzte Methode sorgt für höhere Flexibilität, da Mischungen / Konzentrationen durch einfaches Tuning der relativen Flussraten modifiziert werden können. Es wird darauf hingewiesen, dass für die Verkapselung von Zellen, die Zellsuspension in die Spritze gerührt sollte, um Kondensation der Zellen über die Zeitskala des Experiments zu vermeiden. Fluoreszenz-Datenerfassung. Paar das elektronische Signal von der Avalanche-Photodiode Detektor (beschrieben in 2.2.12), um ein Multifunktions-Datenerfassungsgerät für die Datenerfassung (zB eine PCI 6602, National Instruments), die auf einem Personal Computer. Für FLIM Experimente die Detektoren eine Verbindung zu einem Time-Correlated Single Photon Counting (TCSPC) Karte (zB TimeHarp 100, PicoQuant GmbH) läuft auf einem separaten PC. Diese Karte ermöglicht Fluoreszenzlebensdauer Daten unter Verwendung eines TCSPC Methodik: jeder erkannten fluoreszierende Photon auf einen Vorfall Laserpuls korreliert und daher jede emittierte fluoreszierende Photon ist eine Verzögerungszeit zugeordnet. Diese Datenkann auf ein einzelnes oder multi-exponentiellen Kurve, um eine Schätzung des Fluorophors / s strahlenden Rate Koeffizient / s. erhalten ausgestattet werden Dekonvolution der Rohdaten mit dem Instrument Response-Funktion (IRF) des Detektors: Diese erhält man mit einer niedrigen Konzentration Auramin-O-Lösung (die ein Fluoreszenz-Lebensdauer von wenigen Pikosekunden Exponate) 8. 4. Zell-Erkennung und Kartierung der Durchmischung innerhalb der Tröpfchen Zell-Erkennung und Kartierung der Durchmischung innerhalb der Tröpfchen Verwenden Sie Escherichia coli-Stamm Top 10 für die Lebensfähigkeit Assay Experiment. Kultur der Zellen in Luria-Bertani Bouillon über Nacht und entsprechen der optischen Dichte bis 0,5 vor den Experimenten. Verwenden Sie 0,4 uM SYTO9 und 1 uM Propidiumiodid zur Erfassung der Lebensfähigkeit der Zellen. Beide sind DNA-interkalierende Farbstoffe und deren Fluoreszenz-Intensität steigt um über 20 Falten auf die Bindung an DNA. SYTO9 ist ein grün fluoreszierenden Farbstoff, der mich istmbrane durchlässig und Propidiumjodid ist ein roter Fluoreszenzfarbstoff, der Membran undurchlässig ist. So lebenden Zellen fluoreszieren "grün", während tote Zellen sowohl "grün" und "rot"-Emissionen aufweisen. Verwenden Sie das Setup in 2.2 eingeführt) für grün / rot Fluoreszenz-Detektion. Verwenden Sie ein tragbares, Mini-Magnetrührer (Utah Biodiesel Supply, Utah), die Zellsuspensionen in einem 3 ml BD Plastipak Spritze mit einem 7mm Rührfisch zu Zelle Sedimentation zu verhindern ausgestattet rühren. Mapping von Misch-Ereignisse mit FLIM Fokus der optischen Sonde Volumen auf halber Höhe eines Mikrokanals entlang der Tröpfchen fließen. Form von Tropfen aus zwei wässrigen Lösungen (wie in Abbildung 3c), die jeweils eine (nicht-interagierenden) Fluorophor mit unterschiedlichen charakteristischen Fluoreszenz-Lebensdauer. Beginnend von einer Seite des Kanals, führen jedes Experiment über die gesamte Breite des Kanals bei 1 um Abständen. Der Kanal edges können leicht identifiziert werden, wie die Fluoreszenz-Intensität sinkt drastisch, wenn der Laserstrahl in ihrer Nähe fokussiert wird. Implementieren Sie einen Algorithmus, um Signalbursts (verbunden mit Tropfen) von der Geräuschkulisse der Ölphase zu differenzieren und die Dauer der einzelnen Burst zu etablieren. Implementieren Sie einen zweiten Algorithmus, um die Verzögerungszeit und die Intensität Werte entlang der Länge der einzelnen Tropfen Extrakt bei der jeweiligen Breite, wo das Experiment durchgeführt wurde. 9 Dann mit einem Maximum Likelihood Estimator (MLE) Algorithmus, um die Fluoreszenz-Lebensdauer für jedes Tröpfchen in das Experiment zu bewerten. 8 Averaging die Lebensdauer-Werte für alle die Tropfen in das Experiment, verringert die endgültige Fehler der MLE-Berechnung (die mehr Tröpfchen untersucht, die Je kleiner der Fehler). Einmal im Leben Flugbahn hat für jede Breite gewonnen, vereinen alle Bahnen in einer 2D-Karte. Da jeder Wert für die Lebensdauer ist mit einem besonders verbundenlar Mischung der beiden Fluorophore, kann eine Konzentration (oder Vermischung) Karte erhalten werden. Optional können ein 3D-Karte Tropfen Mischen leicht durch Wiederholung dieses Protokoll an verschiedenen Positionen entlang der Höhe der mikrofluidischen Kanal bezogen werden. 5. Datenanalyse Interpretieren die rohe experimentellen Daten-Dateien in die entsprechenden Computer-Sprache, so dass sie weiter analysiert werden (z. B. Textdateien, die Variation der Photonen im Laufe der Zeit enthalten, können leicht in Matlab werden für die Datenverarbeitung und-analyse extrahiert). Möglicherweise müssen Sie spezielle Codes zu schreiben, um die Daten in Dateien von komplexeren Experimenten (z. B. für FLIM) oder um enthaltenen MLE Algorithmen auszuführen oder 2D-Karten zu mischen prasselt von Lebenszeit Trajektorien zugreifen. 6. Repräsentative Ergebnisse Zell-Erkennung Typische Beispiele für die varausstrahlenden Photonen als Funktion der Zeit für die zell-basierte Experimente sind in den Abbildungen 4a und c gezeigt, über einen Zeitraum von 200 Millisekunden. Wichtig ist die Luria-Bertani Broth (LB-Medium) als schwach fluoreszierenden Hintergrund der Definition der wässrigen Tröpfchen Grenzen wirkt, während verschiedene Photonensalven, entsprechend der Anwesenheit von einzelnen Zellen, kann auf diesem Hintergrund zu unterscheiden. Die LB fluoreszierenden Hintergrund wird von einem etwa rechteckigen Querschnitt (markiert durch den roten und grünen gestrichelten Linien) gekennzeichnet. Die Halbwertsbreite (FWHM) von fluoreszierenden platzt aus E. coli-Zellen 30-fach kleiner als der Hintergrund Tropfen Ereignisse, die im Einklang mit der relativen Länge der Tropfen (40 Mikrometer, das entspricht einem Volumen von 30 Picoliter) und E. ist coli-Zellen (1.5-2.0 Mikron). 10 Mit dem Dual-Channel-ErkennungIonen-System, das Vorhandensein von lebenden Zellen oder abgestorbene Zellen können aus der Analyse der grünen und roten Kanälen unterschieden werden. Abbildungen 4 b und d zeigen die Wahrscheinlichkeitsverteilung beschreibt die Anzahl der Zellen pro Tröpfchen. Mapping von Misch-Ereignisse mit FLIM Die molekulare Fluoreszenz-Lebensdauer ist eine intrinsische Eigenschaft eines einzelnen Fluorophors, die nur von ihrer chemischen Umgebung beeinflusst wird. Entsprechend ihrer Messungen können verwendet werden, um Informationen über die Umwelt (z. B. pH, Temperatur, Polarität und Viskosität) mit überlegener Auflösung und Genauigkeit als die Zeit integrierten Fluoreszenz-Messungen, die abhängig von experimentellen Faktoren (wie Konzentration, Anregungsintensität und optische Sammlung sind zu erhalten Effizienz). 9,11 Wie an anderer Stelle, 8 ist es möglich, die Vermischung Muster in Tröpfchen mit Hilfe von zwei Fluorophoren mit di Kartefferent Lebensdauer Werte. In einer Mischung aus zwei (nicht wechselwirkenden) fluoreszierende Spezies der Zerfall wird auf einem biexponentielle Form annehmen, wie in Gleichung 1 dargestellt ist: Die einzelnen Lebenszeiten als τ1 und τ2 definiert, und die Amplitude der einzelnen Komponenten wird durch α1 und α2 gegeben bzw.. Die durchschnittliche Lebensdauer kann dann wie folgt definiert werden: Wo β1 und β2 sind der Anteil der einzelnen Komponenten und sind wie folgt definiert: Da die Sonde Volumen ist fix und Tröpfchen werden in dieser Position fließt, Werte eine Flugbahn des Lebens entlang der Länge der Tröpfchen an, dass bestimmte Breite kann dabei gewonnenen Erkenntnissen. Eine charakteristische Flugbahn für eine bestimmte Breite, AVERAGed unter 6000 Tropfen können in Abbildung 5a beobachtet werden. Die Kombination der Bahnen in der gesamten Breite des Kanals führt zur Bildung eines 2D-Konzentration (oder Vermischung) Karte. Ein typisches Ergebnis ist in Abbildung 5b dargestellt. Durch die Mittelung der Ergebnisse bei einer großen Anzahl von Tröpfchen können die Standardfehler der erzielten Ergebnisse erheblich reduziert werden (1% der Standard-Fehler mit einem 95%-Konfidenzintervall für die Abbildung 5a). Die Methode zur Bestimmung der Lebensdauer Flugbahn davon aus, dass alle Tröpfchen praktisch identisch sind. Dies erweist sich als weitgehend richtig aus zwei Gründen: Wenn Tröpfchen waren signifikant unterschiedlich, die durchschnittlich Lebenszeit Bahnen erhalten haben, flacher wäre, weniger divergierende Profile (und scharfe Unterschiede in Lebens entlang der Länge des gemittelten Tröpfchen werden konsequent erkannt). Darüber hinaus sind die Ergebnisse reproduzierbar, unabhängig von der individuellenTröpfchen analysiert oder die Menge der Tröpfchen in den Berechnungen verwendet. 8 Abbildung 1. Prozessablauf auf dem Mikrofluidik-Chip-Fertigung. Abbildung 2 a) Schematische Darstellung der Spritzenpumpen und Spritzen, verbunden mit dem Mikrofluidik-Chip für Tropfenbildung; b) Schematische Darstellung eines typischen optischen Aufbau für eine Zwei-Laser – zwei Fluorophor (grün und rot) Anregung und Detektion.. DC = dichroitische Spiegel, EM = Emission-Filter, L = Linse, PH = Pin Loch, APD = Avalanche-Photodioden-Detektor. Abbildung 3 On-Chip Tropfenbildung Strategien: a) flow-Fokussierung Konfiguration; b) T-Kreuzung Konfiguration.. c) Auf Chipverguss in droplets von zwei ursprünglich getrennten wässrigen Reagenzien. Abbildung 4 Optische Auslesung von 0,2 s Spuren für (a) tot protokolliert, und (c) lebende Zellen (Flussraten für Zellsuspension: 1 ul min -1, Öl: 2 ul min -1).. Jeder bogenförmige Signal entspricht der schwach fluoreszierende LB-Medium, dass die wässrige Tropfen bildet, mit Tropfen Grenzen mit gestrichelten Linien markiert. Grüne Signale stellen Auslesen unter 633nm und rot-Signale über 633 nm Wellenlänge. Die Zellen werden durch die vertikale Spikes aus der DNA interkalierende Farbstoffe aus. Wahrscheinlichkeitsverteilung für die zelluläre Belegung in einzelnen Tröpfchen für (b) abgestorbenen Zellen und (d) lebende Zellen. Abbildung 5 a) Typische durchschnittliche Lebensdauer Flugbahn entlang der Länge eines Tropfens an einer bestimmten Breite,. B)Typische Darstellung der Kombination aller gemittelten Trajektorien sondiert über die gesamte Breite der Tropfen in ein 2D-Lebensdauer (oder Konzentration in% FITC /% Str-AF488 ausgedrückt) Karte.
