1. Microchip fabricage SU8 meester fabricage. Om microfluïdische kanalen van 40 micrometer hoog, spin coat SU8-50 (Microchem Corp) op een Si wafer bij 3000 tpm te verkrijgen voor 30 s. Zacht bakken op een hete-plaat bij 65 ° C gedurende 5 minuten en 95 ° C gedurende 30 minuten om het oplosmiddel verdampen en verdichten van de film. Na afkoeling, bloot SU8 met 360-440 nm straling te weerstaan van 300 mJ / 2 onder de juiste masker. Na blootstelling, bak de wafer op 65 ° C gedurende 2 minuten en 95 ° C gedurende 4 minuten. Na afkoeling, het ontwikkelen van de niet-belichte gebieden (Micrpoposit EG oplosmiddel, Chestech) gedurende 5 minuten, al roerend koken. 5 Gebruik verse EC oplosmiddel om de wafer dan spoelen en drogen onder gas met een schoon oppervlak te genereren. Behandel de wafer met hexaan en methanol wast. Vul het SU8 meester fabricage proces met een laatste stap van de verdampende trichloor (1,1,2,2-perfluoocytl) silaan op het oppervlak (in een exsiccator gedurende 40 minuten). PDMS Curing, blokjes en perforeren. Om vorm gestructureerde microfluïdische substraten, we mengen Sylgard 184 (Dow Corning) in een 10:1 (w / w) verhouding van hars crosslinker en giet over de knie te krijgen. Degas in een exsiccator, en dan te genezen van het apparaat (bovenste laag) gedurende een uur bij 65 ° C. Snijd de uitgeharde PDMS en pel het van de meester. Maak toegang gaten voor vloeibare buizen met behulp van een biopsie punch. Cure een andere laag van PDMS (8 g van de hars gelijkmatig verdeeld in een 10×10 cm petrischaal) gedurende 20 minuten bij 65 ° C. Plaats de voorbereide bovenste laag op de onderste laag en dan 's nachts bij 65 ° C te genezen Pel de chips van de petrischaal en dobbelstenen voor gebruik. 2. Experimentele opstelling Microfluïdische setup Vul spuiten (plastic of glas uit Beckton, Dickinson and Company of van SGE Analytical Science) met de vereiste oplossingen, zodat er geen luchtbellen zijn in elk deel van de slang. Voor druppel generatie twee fasen worden gebruikt. De waterige (verspreide) PHASe bevat de reagentia van belang (bijvoorbeeld een schorsing van cellen in groei medium, of een oplossing van moleculaire fluoroforen). De olie-fase, die in dit geval fungeert als de continue fase, is over het algemeen gevormd uit een mengsel van olie-en oppervlakte-actieve stof, bijvoorbeeld 2% Raindance oppervlakte-actieve stof (Raindance Technologies) in fluorhoudende olie (3M Fluorinert Electronic Liquid FC-40), of 2% Span 80 (Croda) in minerale olie. Fit buizen (polyethyleen buizen, Harvard Apparatus) van dezelfde inwendige diameter als de naald tips over een einde aan de naalden. De slang moet worden teruggebracht tot de kortst mogelijke duur te laten stromen instabiliteit te wijten aan vibrationele verstoringen te minimaliseren. Sluit de andere uiteinden van de buizen rechtstreeks aan de gaatjes in het PDMS substraat. Meer complexe oplossingen, zoals het gebruik van silica capillaire poorten of connectors (bijv. Upchurch Nanoports) kunnen ook worden geïmplementeerd voor een meer robuuste interface tussen de microfluïdische apparaat en de slang. Verbind de uitgangpoort van de chip om slang en direct in een collector (voor afvalinzameling of verdere analyt verwerking). Monteer de spuiten op een injectiepomp (bijv. PHD 4400 Hpsi programmeerbare spuit pompen, Harvard Apparatus) en definiëren van de gewenste inbrengen debiet voor elke fase (meestal in de orde van microliter per minuut). Een minimale verhouding van olie / water debiet van 1 wordt aanbevolen om bevochtiging van het PDMS te voorkomen door de waterige fase, die zou leiden tot onstabiele druppelvorming (afhankelijk van het apparaat geometrie). Om dezelfde reden is het ook aanbevolen om eerst alleen spoelen van de olie-fase, door middel van een microfluïdische kanalen, vóór de invoering van de waterige fase. De uiteindelijke opstelling wordt gebruikt voor de experimenten hierin wordt geïllustreerd in figuur 2a. Optisch systeem setup Om kleine volumes (tot een paar picoliter) probe binnen de microfluïdische kanalen met een hoge ruimtelijke en temporele resolutie gebruik maken van een confocale microscoop (met automaated submicron positionering van capaciteit). Gebruik water oplosbare fluorescerende moleculen met een ideale hoge quantum opbrengst. Excite van de moleculen met behulp van een laser met een golflengte die de absorptie van de betrokken fluorofoor wedstrijden. Zo kan bijvoorbeeld gemeenschappelijke fluorescerende moleculen, zoals fluoresceïne 5-isothiocyanaat (FITC) en de Alexa-Fluor 488 efficiënt worden opgewekt met behulp van een 488 nm diode laser (bijv. PicoQuant Gmbh, LDH-PC-485). Fluorescerende moleculen, zoals Texas Red of Allophycocyanin (APC) efficiënt kan worden verlaten bij 633 nm met behulp van een He / Ne laser (bijv. Newport R-31425). Gebruik gepulste lasers werken op herhaling tarieven van een aantal MHz (met diverse ns puls scheidingen) en fluoroforen met een voldoende gedifferentieerd levenslange eigenschappen voor Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM) experimenten. Gebruik beam-spiegels en optica om de bundel hoogte als breedte richting controle. Gebruik een dichroïsche spiegel om de laserstraal reflecteren in de doelstelling lens. Als twee lasers tegelijk gebruikt, kan een dual-band dichroic spiegel worden geïnstalleerd om reflectie van de twee laserstralen (bijvoorbeeld voor 488 en 633 nm balken een z488/633rdc spiegel van Chroma Technology Corporation is ideaal) mogelijk te maken. Gebruik een oneindig-gecorrigeerde, hoge numerieke apertuur (NA) microscoop objectief (dat wil zeggen Olympus 60 x / 1,2 NA, onderdompeling in water) om het laserlicht te brengen tot een strakke focus binnen een microfluïdische kanaal. Bij het werken met hoge microkanalen (> 100 um) gebruikt de doelstelling moet op passende wijze worden gekozen om ervoor te zorgen dat de machine op afstand effectief de volledige hoogte van de microkanaal dekt. Verzamel fluorescentie uitgezonden door het monster (binnen de microfluïdische kanaal) met behulp van dezelfde hoge NA doel en overgedragen via dezelfde dichroïsche spiegel. Verwijder eventuele resterende excitatie licht met behulp van een enkel-of dual-band emissie filter (bv. een z488/633 filter van Chroma Technology Corporation). Focus van de fluorescentie emission op een 75 urn gaatje met behulp van een plano-convexe lens (bv +50.2 F; Newport Ltd). Plaats de pinhole in de confocale vlak van de microscoop doelstelling. Gebruik een andere dichroïsche spiegel (bijv. 630dcxr, Chroma Technology Corporation) om het fluorescerende signaal splitsen naar twee detectoren. Filter de fluorescentie gereflecteerd door de dichroïsche spiegel met een emissie-filter (bijv. een hq540/80 m filter van Chroma Technology Corporation) en focus met een plano-convexe lens (bijv. f = 30,0, 25,4 mm id, Thorlabs) op de eerste ( 'groene') detector. Voor experimenten met een tweede rode fluorofoor filter de fluorescentie die door de dichroïsche spiegel met een andere emissie-filter (bv een hq640lp filter van Chroma Technology Corporation) en dan focussen met een andere plano-convex lens op de tweede ('rode') detector. Gebruik lawine fotodiodes (bijv. AQR-141, EG & G, Perkin Elmer) voor detectie van fluorescentie fotonen. De laatste setup is geïllustreerd in <strong> Figuur 2b. 3. Droplet generatie en data-acquisitie Droplet generatie methoden U kunt gebruik maken van twee belangrijke configuraties van microkanalen tot druppeltjes genereren: een stroom gericht of een T-splitsing formaat (Figuur 3a en 3b) 6,7 Beide methoden zijn gelijkwaardig, zolang vormden de druppels zijn zo breed als de microkanaal zelf.. Als gevolg van de dwarskrachten die voortvloeien uit het gebruik van deze geometrieën bij elkaar te brengen van de twee niet-mengbare vloeistoffen en de daarop volgende capillaire instabiliteiten die zich ontwikkelen in de interface, monodisperse druppeltjes (zo klein als een paar femtoliters) zijn spontaan ontstaan. U kunt kapselen reagentia op verschillende manieren: reagentia kan worden voorbereid en gemengd af chip op de gewenste mengsel / concentratie, of ze afzonderlijk kunnen worden gebracht in de chip en dan gecombineerd voorafgaand aan de druppelvorming (figuur 3c). Dezelaatste methode geeft voor een hogere flexibiliteit omdat mengsels / concentraties kunnen worden gewijzigd door simpelweg het afstemmen van de relatieve flow-tarieven. Opgemerkt wordt dat voor de cel inkapseling, de cel suspensie in de injectiespuit moet worden geroerd om condensatie van de cellen over de tijdschaal van het experiment te voorkomen. Fluorescentie data-acquisitie. Koppel het elektronische signaal van de lawine fotodiode detector (beschreven in 2.2.12) tot een multifunctionele DAQ apparaat voor data logging (bijvoorbeeld een PCI-6602, National Instruments), die op een personal computer. Voor FLIM experimenten sluit de detectoren om een Time-gecorreleerde Single Photon Counting (TCSPC) kaart (bijv. TimeHarp 100, PicoQuant GmbH) draait op een aparte pc. Deze kaart zorgt voor fluorescentie levensduur gegevens worden verkregen met behulp van een TCSPC methodologie: elke gedetecteerde tl-foton is gecorreleerd aan een incident laserpuls, en dus iedere uitgezonden TL-foton krijgt een vertragingstijd. Deze gegevenskan worden gemonteerd op een enkel-of multi-exponentiële verval curve een schatting van de fluorofoor / s radiatieve tarief coëfficiënt / s. verkrijgen Deconvolute de ruwe data met het instrument response functie (IRF) van de detector: dit is verkregen met een lage concentratie auramine-O-oplossing (die een fluorescentie levensduur van een paar picoseconden vertoont) 8. 4. Cel herkenning en in kaart brengen van het mengen binnen de druppels Cel herkenning en in kaart brengen van het mengen binnen de druppels Gebruik Escherichia coli stam Top 10 voor de levensvatbaarheid test experiment. Cultuur van de cellen in Luria-bouillon Bertani 's nachts en overeenkomen met de optische dichtheid tot 0,5 voorafgaand aan de experimenten. Gebruik 0,4 uM SYTO9 en 1 uM propidiumjodide voor het detecteren van de levensvatbaarheid van de cellen. Beide zijn DNA-intercalerende kleurstoffen en hun fluorescentie-intensiteit stijgt met meer dan 20 plooien bij de binding aan DNA. SYTO9 is een groen fluorescerende kleurstof dat ben ikmbrane doorlatend en propidiumjodide is een rode fluorescerende kleurstof die is ondoordringbaar membraan. Zo levende cellen lichten 'groen', terwijl dode cellen vertonen zowel 'groene' en 'rood' uitstoot. Gebruik de setup geïntroduceerd in 2.2) voor de groen / rode fluorescentie detectie. Gebruik een draagbare mini-magneetroerder (Utah Biodiesel Supply, Utah) om de celsuspensies roeren in een 3 ml BD Plastipak injectiespuit voorzien van een 7 mm magnetische roerstaaf naar cel sedimentatie te voorkomen. In kaart brengen van het mengen van gebeurtenissen met FLIM Focus van de optische sensor volume op de helft van de hoogte van een microkanaal waarlangs druppeltjes stromen. Vorm van twee druppeltjes waterige oplossingen (zoals in figuur 3c), elk met een (non-interactie) fluorofoor met verschillende karakteristieke fluorescerende levens. Begin van de ene kant van het kanaal, het uitvoeren van elk experiment over de hele breedte van het kanaal op een urn intervallen. Het kanaal edGES kan gemakkelijk worden geïdentificeerd als de fluorescentie-intensiteit daalt drastisch zodra de laserstraal is gericht in hun nabijheid. Implementeer een algoritme om het signaal barst (geassocieerd met druppels) te onderscheiden van het lawaai achtergrond van de olie-fase en voor de duur van elke burst vast te stellen. Implementeren van een seconde algoritme om de vertragingstijd en intensiteit waarden extract langs de lengte van elke druppel op de bijzondere breedte waar het experiment is uitgevoerd. 9 Maak dan gebruik van een Maximum Likelihood Estimator (MLE) algoritme om de fluorescentie levensduur van elke druppel in het experiment te evalueren. 8 het gemiddelde van de levensduur van waarden voor alle de druppels in het experiment, de laatste fout van de MLE berekening (hoe meer druppels gepeild, vermindert de Hoe kleiner de fout). Zodra een leven lang traject is verkregen voor elke breedte, combineren alle trajecten in een 2D-kaart. Omdat elk leven waarde is gekoppeld aan een bijzonderLAR mengsel van de twee fluoroforen, kan een concentratie (of vermenging) map dus worden verkregen. Optioneel kan een 3D-kaart van druppel mengen gemakkelijk worden verkregen door het herhalen van dit protocol op verschillende plaatsen langs de hoogte van de microfluïdische kanaal. 5. Data-analyse Herinterpreteren de ruwe experimentele data-bestanden naar de juiste computer-taal, zodat ze verder kan worden geanalyseerd (bijvoorbeeld tekstbestanden die de variatie van het foton telt na verloop van tijd bevat, gemakkelijk kan worden geëxtraheerd in Matlab voor dataverwerking en-analyse). Je zou kunnen hebben aan specifieke codes schrijven om de gegevens in bestanden van meer complexe experimenten (zoals die voor FLIM), of om MLE algoritmes uit te voeren of 2D-kaarten van het mengen van patronen op te bouwen van leven trajecten toegang. 6. Representatieve resultaten Cel herkenning Typische voorbeelden van de variation van foton geldt als een functie van de tijd voor de cel-gebaseerde experimenten zijn weergegeven in de figuren 4a en c, over een periode van tweehonderd milliseconden. Belangrijk is dat de Luria-Bertani bouillon (LB medium) fungeert als een zwak fluorescerende achtergrond het definiëren van de waterige druppel grenzen, terwijl de verschillende foton barst, wat overeenkomt met de aanwezigheid van individuele cellen, kunnen worden onderscheiden op de top van deze achtergrond. De LB fluorescerende achtergrond wordt gekenmerkt door een ongeveer rechthoekige doorsnede (gemarkeerd door de rode en groene stippellijnen). Over de volle breedte half maximum (FWHM) van tl-uitbarstingen als gevolg van E. coli-cellen is 30-voudig korter is dan de achtergrond druppel gebeurtenissen, die in overeenstemming is met de relatieve lengte van de druppels (40 micron, wat overeenkomt met een volume van 30 picoliter) en E. coli-cellen (+1,5 tot 2.0 micron). 10 Met de dual channel te detecterenion-systeem, het bestaan van levende cellen of dode cellen kunnen worden onderscheiden van de analyse van de groene en rode kanalen. Figuren 4, onder b en d tonen de kansverdeling beschrijven van het aantal cellen per druppel. In kaart brengen van het mengen van gebeurtenissen met FLIM De moleculaire fluorescentie levensduur is een intrinsieke eigenschap van een individu fluorofoor dat wordt alleen beïnvloed door de chemische omgeving. Daarom zijn metingen kunnen worden gebruikt om de milieu-informatie (zoals de oplossing pH, temperatuur, polariteit en viscositeit) te verkrijgen met een superieure resolutie en precisie dan de tijd geïntegreerde fluorescentie metingen, die afhankelijk zijn van experimentele factoren (zoals concentratie, excitatie-intensiteit, en optische collectie efficiëntie). 9,11 Zoals elders gepresenteerd, 8 is het mogelijk om het mengen patronen in druppels kaart door het gebruik van twee fluoroforen met diandere kleur heeft levensduur van waarden. In een mengsel met twee (non-interactie) fluorescerende soorten het verval zal plaatsvinden op een bi-exponentiële vorm zoals blijkt uit vergelijking 1: De individuele levens worden gedefinieerd als τ1 en τ2, en de amplitude van elke component wordt gegeven door α1 en α2 respectievelijk. De gemiddelde levensduur kan dan als volgt worden gedefinieerd: Waar β1 en β2 zijn de fractie van elk onderdeel en worden als volgt gedefinieerd: Omdat de sonde volume is vast en druppels stromen over die positie, een traject van de levensduur waarden langs de lengte van de druppels op die bepaalde breedte kan worden verkregen. Kenmerkend traject voor een bepaalde breedte, averaged onder de 6.000 druppels, kan worden waargenomen in figuur 5a. Het combineren van de trajecten gedurende de gehele breedte van het kanaal leidt tot de vorming van een 2D-concentratie (of menging) kaart. Een typisch resultaat is weergegeven in figuur 5b. Door het gemiddelde van de resultaten van een groot aantal van druppels, kan de standaardfout van de verkregen resultaten sterk worden verminderd (1% van de standaard fout met een 95%-betrouwbaarheidsinterval voor figuur 5a). De methode voor de bepaling van de levensduur traject gaat ervan uit dat alle druppels zijn praktisch identiek. Dit is bewezen dat grotendeels correct om twee belangrijke redenen: als druppels waren significant verschillend, de gemiddelde levensduur verkregen trajecten zou zijn vlakker, minder uiteenlopende profielen (en scherpe verschillen in leven langs de lengte van de gemiddelde druppels consequent gedetecteerd). Bovendien zijn de resultaten reproduceerbaar zijn, ongeacht de individueledruppeltjes geanalyseerd of de hoeveelheid druppels worden gebruikt in de berekeningen. 8 Figuur 1. Processtroom op de microfluïdische chip fabricage. Figuur 2 a) Diagram die de spuit pompen en spuiten, aangesloten op de microfluïdische chip voor druppelvorming; b) Schematische weergave van een typische optische setup voor een twee laser – twee fluorofoor (groen en rood), excitatie en detectie.. DC = Dichroic spiegel, EM = Emission filter, L = Lens, PH = Pin hole, APD = Avalanche fotodiode detector. Figuur 3 On-chip druppelvorming strategieën: een) flow-focusing configuratie; b) T-splitsing configuratie.. c) Op chip inkapseling in droplets van twee oorspronkelijk gescheiden waterige reagentia. Figuur 4 optische uitlezing van 0,2 s sporen opgenomen voor (een) dode en (c) levende cellen (debieten voor celsuspensie: 1 pl min -1, olie: 2 pl min -1).. Elke boog-vormige signaal komt overeen met de zwak fluorescerende LB medium dat de waterige druppel vormen, met druppel grenzen gemarkeerd met stippellijnen. Groene signalen vertegenwoordigen uitlezen onder 633nm en rode signalen over 633 nm golflengte. Cellen onderscheiden zich door de verticale piek die voortvloeien uit de DNA intercalerende kleurstoffen. Kansverdeling voor cellulaire bezetting binnen enkele druppels voor (b), dode cellen en (d) levende cellen. Figuur 5 a) Typische gemiddelde levensduur traject langs de lengte van een druppel op een bepaald breedte;. B)Typische vertegenwoordiging van de combinatie van al de gemiddelde trajecten gepeild over de volle breedte van de druppels in een 2D-leven (of concentratie, uitgedrukt in% FITC /% Str-AF488) kaart.
