荧光检测方法，为微流体液滴平台

1。 Microchip的制造 SU8主制造。 要获得30秒40微米的高度，一个硅晶片上旋涂SU8 – 50（MicroChem公司）在3000转的微流体通道软烤热板在65 ° C时5分钟和95 ° C下30分钟蒸发溶剂和致密的薄膜。冷却后，暴露在300兆焦耳/ 2 SU8抵制360-440 nm的辐射下适当的口罩。曝光之后，晶圆烘烤在65 ° C时2分钟，4分钟，95℃。冷却后，制定并搅拌5分钟未曝光的地区（Micrpoposit EC溶剂，Chestech），（ 五）使用新鲜欧共体溶剂冲洗晶圆然后干下气体产生一个干净的表面。治疗正己烷和甲醇清洗晶圆。 SU8掌握制造过程，完成的最后一步（1,1,2,2 – perfluoocytl）蒸发三氯硅烷表面上（在40分钟的干燥器）。 PDMS的curinG，切割和打孔。 要形成结构的微流体基板，我们在10:1（W / W）树脂交联剂的比例混合Sylgard 184（道康宁），然后倒在主。德加干燥器中，然后治设备（顶层）为一小时，在65 ° C。切了主治愈的PDMS和剥离。创建访问孔，流体管，用活组织检查打孔。固化的PDMS的另一层为20分钟（8克）均匀撒在一个10×10厘米的培养皿中的树脂，在65 ° C。将准备的顶层和底层，然后一夜之间治愈在65 ° C。剥离芯片从培养皿和使用的骰子。 2。实验装置微流控设置注射器（塑料或玻璃从Beckton Dickinson公司或从上海黄金交易所分析科学）填写所需的解决方案，确保无气泡留在油管的任何部分。液滴生成​​两个阶段使用。水溶液（分散）PHASE包含感兴趣的试剂（例如在生长介质中的悬浮细胞或分子荧光团的解决方案）。在这种情况下行为作为连续相，油相，一般是形成从石油和表面活性剂的混合物，如飞雨表面活性剂在2％氟化油（飞雨技术）（3M Fluorinert电子液体FC – 40）;或2％在矿物油（Croda Singapore禾）跨度80。 适合一端的针的注射器针尖一样的内部直径的管材（聚乙烯管，哈佛仪器）。应切断管子，以最短的长度，以尽量减少由于振动扰动流不稳定。 连接油管的另一端，直接在PDMS基板砸出的洞。更复杂的解决方案，如使用石英毛细管端口或连接器（如厄普丘奇Nanoports），也可以实现一个更强大的界面之间的微流体装置和油管。连接插座港口的油管和直接到收藏家（废物收集或进一步分析物的处理）芯片。 装入注射泵的注射器（如博士4400 Hpsi可编程的注射泵，哈佛仪器），并定义每个阶段（通常微升每分钟）所需的注入流量。一个建议，以避免水相，这将导致液滴的形成不稳定（取决于设备几何）的PDMS润湿的最低比例是1流油/水率。出于同样的原因，它也建议，先冲洗油相单独任何微流体通道，通过引进水相前，。用于本实验的最终设置是在图2a所示。 光学系统设置为了探测高时空分辨率的微流体通道内的小卷（几皮升）使用共聚焦显微镜（带自动贩卖机版次微米定位能力）。 使用理想的高量子产率的水溶性荧光分子。激发分子使用的波长相匹配所涉及的荧光团吸收激光的操作。例如，可以有效地激发常见的荧光分子，如荧光素异硫氰酸（FITC）和Alexa Fluor公司488使用488纳米激光二极管（如PicoQuant有限公司，LDH – PC – 485）。在633 nm，荧光分子，如得克萨斯州红色或变藻蓝蛋白（APC），可以有效地退出使用他/ Ne激光（如新港的R – 31425）。 使用脉冲激光在几MHz的重复率（几个ns脉冲分离）和足够的有区别的一生属性，荧光寿命成像（FLIM）实验的荧光团经营。 使用光束控制反射镜和光学控制梁的高度，以及光束的方向。 使用分色镜反映到客观升的激光束ENS。如果两束激光同时使用，可以安装双频段分色镜使反射的两束激光（如488和633 nm的光束从色度科技股份有限公司z488/633rdc镜是理想的）。 使用无限远校正，高数值孔径（NA）显微镜物镜（即奥林巴斯60 × / 1.2 NA，水浸泡），使一个微流体通道内的激光光紧张的焦点。高大微（> 100微米）的工作时使用的目标，必须适当选择，以确保其工作距离有效地覆盖全高度的微。 收集的样品，使用相同的高NA目标，并通过相同的分色镜传输（微流体通道内）发出的荧光。 使用单频段或双频段发射过滤器（例如，从色度科技股份有限公司z488/633过滤器），除去残留的激发光。 聚焦荧光emissioN到75微米的针孔，使用一个平凸透镜（如50.2 F，新港有限公司）。共聚焦显微镜物镜平面位置的针孔。 使用另一种分色镜（如630dcxr科技股份有限公司，色度）分离到两个探测器的荧光信号。 过滤排放过滤器（如hq540/80米的色度滤波器技术公司）的分色镜反射的荧光和一个平凸透镜的焦点（例如，F = 30.0，内径25.4毫米，Thorlabs）到第（ '绿色'）探测器。对于涉及次要的红色荧光团的实验传输排放过滤器（例如，一个从色度科技股份有限公司hq640lp滤波器）与另一分色镜过滤的荧光，然后集中到第二个探测器（“红”）与另一平凸透镜。 用于检测荧光光子雪崩光电二极管（如AQR – 141，EG＆G公司，在Perkin – Elmer）。最后的安装说明<strONG>图2b。 3。液滴的生成和数据采集液滴的生成方法您可以使用两个主要的微配置产生水滴：注重一个流或丁字路口的格式（图3a和 3b）6,7两种方法都相当于只要形成液滴作为微本身。由于使用这些几何图形将两个不混溶流体和接口的后续发展毛细管的不稳定，是自发产生的单分散液滴（如一些femtoliters小）产生的剪切力的结果。 您可以以不同的方式封装的试剂：试剂可以准备和混合所需的混合浓度/关闭芯片，或者他们可以被分开到芯片，然后结合在一起之前，液滴的形成（ 图 3c ）。这最后的方法提供了更高的灵活性，因为混合物/浓度，可以通过简单的调整相对流率修改。据悉注射器中的细胞悬液，细胞封装，应搅拌，以避免凝结的细胞在实验的时间表。 荧光数据采集。 夫妇的雪崩光电二极管检测器（2.2.12）的电子信号多功能DAQ设备的数据记录（例如，美国国家仪器公司的PCI 6602），在个人电脑上运行。 对于FLIM的实验探测器连接到一个时间相关单光子计数（TCSPC）卡（如TimeHarp 100，PicoQuant有限责任公司），一个单独的PC上运行。此卡允许使用的TCSPC方法获得的荧光寿命数据：每个检测到的荧光光子相关的入射激光脉冲，因此每个发出的荧光光子被分配了一个延迟时间。此数据可以安装在一个单个或多个指数衰减曲线获得的荧光/ s的辐射率系数/ s的估计Deconvolute的原始数据，仪器响应函数（IRF）的探测器：这是使用低浓度金胺O解决方案（其中展品的几个皮秒荧光寿命）8 。 4。混合液滴内的细胞识别和映射混合液滴内的细胞识别和映射使用大肠杆菌十大应变检测的可行性实验。卢里亚- Bertani肉汤隔夜培养细胞实验前相匹配的光密度为0.5。 0.4μMSYTO9和1μM碘化丙啶用于检测细胞的可行性。 DNA插层染料与DNA结合后其荧光强度增加20倍以上。 SYTO9是一种绿色荧光染料，那就是我mbrane透水和碘化丙啶是一种红色荧光染料膜防渗。因此，活细胞荧光的“绿色”而死​​亡的细胞表现出“绿色”和“红”排放。 使用绿色/红色荧光检测设置在2.2中引入）。 使用便携，迷你磁力搅拌器（犹他州生物柴油的供应，犹他州）内挑起一个3ML BD plastipak注射器装的7mm的磁力搅拌棒，以防止细胞沉淀的细胞悬液。 使用FLIM的混合事件的映射光学探针量集中在一个微液滴沿都流淌着高度的一半。 从两个水溶液（ 图3c），每个包含一个具有不同特点的荧光寿命（非交互）荧光团的表格滴。 从通道一侧开始，开展沿整个宽度在1微米的间隔通道的每一个实验。渠道版GES可以很容易地确定荧光强度急剧下降，一旦激光束集中在其附近。 实现算法，以区别于背景噪声信号连发（与水滴）油相，并建立每个突发时间。 实施第二个算法提取实验已经进行了特定的宽度沿每个液滴的长度的延迟时间和强度值9 。 然后使用最大似然估计（MLE）的算法，以评估为每个液滴在实验中的荧光寿命。8，在实验中的所有液滴的平均寿命值，降低最终的MLE计算错误（更多的水滴探测，误差越小）。 一旦已获得各宽一生的轨迹，结合在2D地图上的所有轨迹。由于每个终身价值是与特定LAR的两个荧光基团的混合物，浓度（或混合）地图可以得到。 另外，一个混合液滴的三维地图，可以很容易获得通过重复这个协议在不同的位置，沿微流体通道的高度。 5。数据分析重新诠释的原始实验数据文件到相应的计算语言，使他们能够得到进一步的分析（如文本文件，包含光子计数随着时间的推移变化，可以随时到Matlab中提取的数据处理和分析）。您可能已经编写特定的代码，以访问包含文件（如为FLIM）在更为复杂的实验，或为了一生的轨迹运行MLE的算法，或建立混合的格局2D地图数据。 6。代表性的成果细胞识别典型的例子的VAR作为一个基于细胞的实验时间功能的光子计数iation显示在图 4a 和 C，超过两百毫秒内。重要的是，卢里亚- Bertani肉汤（LB培养基）确定水液滴边界的弱荧光背景的行为，而不同的光子阵阵，对应于单个细胞的存在，可在此背景下之上区分开来。 LB荧光背景的特点是由约矩形截面（红色和绿色的虚线标记）。 全宽半高（FWHM），荧光阵阵，所产生的大肠杆菌大肠杆菌细胞的30倍，比背景液滴的事件，这是液滴的相对长度（40微米，相当于30 picolitres量）和E.一致短大肠杆菌细胞（1.5-2.0微米）10。 双通道检测离子系统，活细胞或死细胞的存在，可以区别于绿色和红色通道分析图4 B和 D显示的概率分布来描述，每个液滴细胞的数量。 使用FLIM的混合事件的映射分子荧光寿命是个别荧光团，只能由它的化学环境的影响的内在属性。因此，它的测量可以用来获得卓越的分辨率和精度比综合荧光测量，这是依赖于实验因素（如浓度，激发强度和光学收集环境信息（如溶液的pH值，温度，极性和粘度）效率）。9,11 提出的其他地方， 有 8个是地图使用两个荧光基团与DI液滴内的混合模式fferent寿命值。包含两个荧光物种（非交互）的混合物的衰减将在双指数形式如公式1所示： 个人的寿命定义为τ1和τ2和每个组件的幅度分别是由α1和α2。的平均寿命可以被定义如下： 凡β1和β2的每个组件的一小部分，并定义如下： 由于探头体积是固定的，液滴的那个位置上的流动，一生的轨迹，沿着在那个特定的宽度液滴的长度值可以由此获得的。一个特定的宽度特征的轨迹，求均值6000液滴之间的ED，可以观察图 5a 。 贯穿整个通道宽度相结合的运动轨迹，导致形成一个二维的浓度（或混合）地图。一个典型的结果是在图5b。 平均之间的大量水滴的结果，所得到的结果的标准误差可以大大降低（1％与95％置信区间为图 5a的标准误差） 。假定所有的水滴几乎相同的一生轨迹的测定方法。这被证明是基本上正确的，主要有两个原因：如果液滴显著不同，获得的平均寿命轨迹将有平坦，少不同的配置文件（和沿长度平均液滴在一生的尖锐分歧始终检测）。此外，结果重现性好，无论个人液滴分析或液滴的数量计算中使用。 8 图1微流控芯片制造的流程。 图2）图代表的注射泵和注射器，连接到液滴的形成微流控芯片; B）一个典型的两个激光光学装置示意图-两个荧光基团（绿色和红色）的激发和检测 。 DC =分色镜，EM =排放过滤器，L为镜头，PH值=针孔，APD雪崩光电二极管探测器。 图3芯片上的液滴形成战略：一）流重点配置;二）丁字路口配置。 C）在医生的芯片封装oplets，两个原本单独的水溶液试剂。 图4（一）死亡记录的0.2秒的痕迹和光学读数（三）活体细胞（细胞悬液流速：1μL-1分钟，油：2μL 分钟 -1） 。每一个拱形的信号对应的弱荧光LB培养基，形成水液滴，液滴边界标有虚线。绿色信号代表超过633纳米的波长633纳米红色信号的读数。细胞的区别在于垂直插层染料的DNA产生的尖峰。 （二）死亡的细胞和（d）活细胞内单液滴的蜂窝入住的概率分布。 图5 a）典型沿在一个特定的宽度液滴的长度的平均寿命轨迹B ）;平均轨迹相结合的典型代表全宽沿液滴探测到一个二维的寿命（或浓度表示为％FITC /％STR – AF488）地图。