متعامد تنقية البروتين الميسر عن طريق بطاقات تقارب Bispecific الصغيرة
Özet
وقد وضعت الرواية وكفاءة عالية من خطوتين تقارب بروتوكول اللوني ، ويوصف بالتفصيل. يستند هذا الأسلوب على علامة تنقية صغيرة مع اثنين من الصلات الكامنة وينطبق على طائفة واسعة من البروتينات الهدف مع خصائص مختلفة.
Abstract
نظرا للتكاليف العالية المرتبطة تنقية البروتينات المؤتلف البروتوكولات الحاجة إلى الترشيد. الإنتاجية العالية للجهود هناك طلبا على الطرق العامة التي لا تحتاج إلى البروتين الهدف الأمثل محددة 1. لتحقيق ذلك ، ويشيع استخدام العلامات تنقية وراثيا يمكن أن تنصهر في الجينات ذات الاهتمام 2. مؤشر تقارب الأكثر استخداما هو علامة سداسي الحامض الاميني ، الذي هو مناسبة لتنقية تحت كل الظروف المحلية وتغيير طبيعة 3. عبء الأيض لإنتاج علامة منخفضة ، ولكنها لا توفر ونوعية عالية ومنافسة تقارب 1،2 اللوني الاستراتيجيات القائمة.
هنا ، علامة تنقية bispecific مع موقعين ملزمة مختلفة على حمض أميني 46 ، وقد وضعت الصغيرة المجال البروتين. مشتق المجال الألبومين الملزمة من البروتين G العقدية ولها صلة قوية الأصيل في ألبومين المصل البشري(HSA). أحد عشر السطحية المعرضة الأحماض الأمينية ، لم يشارك في ألبومين ملزم 4 ، تم اختيارهم بصورة عشوائية وراثيا لانتاج مكتبة اندماجي. وأعرب عن مكتبة البروتين مع رواية مرتبة عشوائيا سطح ملزمة (الشكل 1) على جسيمات عاثية لتسهيل اختيار المجلدات عن طريق التكنولوجيا عرض فج. من خلال عدة جولات من biopanning ضد مثنوي Z – المجال المستمدة من البروتين والعنقوديات 5 ، صغيرة ، جزيء bispecific مع تقارب هائل سعيد أنعم على حد سواء ، وكان الهدف التعرف على رواية 6.
تم تقييم المجال البروتين الرواية ، ويشار إلى ABDz1 ، بوصفها علامة تنقية لمجموعة مختارة من البروتينات الهدف مع الوزن الجزيئي مختلفة ، والذوبان في نقطة تساوي الكهربية. وأعرب عن البروتينات الثلاث المستهدفة في القولونية Escherishia مع العلامة رواية تنصهر لمصطلحات – N وتنقيته بعد ذلك تقارب. أسفرت تنقية أولية في عمود إما مع أو يجمد HSA Z المجال في relatively المنتجات النقية. أسفرت اثنين خطوة تقارب مع العلامة تنقية bispecific في تحسن كبير من النقاء البروتين. ثبتوا مع وسائل الاعلام الكروماتوغرافي Z – المجال ، MabSelect سبيل المثال المؤكد أن تتوفر بسهولة للتنقية من الأضداد ، ويمكن بسهولة أن يقترن HSA كيميائيا إلى وسائل الإعلام لتقديم المصفوفة الثانية.
هذا الأسلوب هو مفيد خصوصا عندما يكون هناك ارتفاع الطلب على نقاء بروتين هدف استردادها. وbifunctionality العلامة يسمح لاستخدامها خطوتين الكروماتوغرافي مختلفة بينما يقتصر العبء الأيضي على المضيف التعبير نظرا لصغر حجم العلامة. ويوفر بديلا منافسا للعلامات ما يسمى اندماجي حيث تستخدم علامات متعددة في تركيبة 1،7.
Protocol
Discussion
تنقية متعامد تقارب بروتوكول المعروضة هنا يمكن تنقية فعالة لمجموعة واسعة من البروتينات الهدف. من خلال الجمع بين موقع المتأصلة ملزمة المجال الألبومين ملزمة مع سطح ملزمة الرواية ، وقد وضعت علامة صغيرة bispecific البروتين. انها واضحة جدا للاستفادة من البطاقات حيث يمكن ببساطة أن تكون مستنسخة ، وأعرب عن الانصهار في أي بروتين من مصلحة في أي ناقلات التعبير المفضل. ويمكن استخدام التجهيزات القياسية المتوفرة في معظم المختبرات لتنقية البروتين من خطوتين. لأن وظيفة العلامة ABDz1 يعتمد على طي الصحيح المجال لفضح لها بكفاءة سطحين ملزمة ، ويقتصر أسلوب للبروتينات المعبر عنها في شكل قابل للذوبان وغير مناسبة لتغيير طبيعة التنقيات في ظل ظروف. وينبغي أيضا خفض عوامل يمكن تجنبها لأنها تتداخل مع ربط ABDz1 إلى Z – المجال على مصفوفة MabSelect بالتأكيد.
متعامد تقارب purificaنشوئها يوفر بديلا مفيدا للأساليب التقليدية من أجل تلبية متطلبات عالي النقاء البروتينات الموجودة في العديد من التطبيقات تطلبا. في نفس الوقت ، هذا الأسلوب يلغي الحاجة لوضع علامات اندماجي عندما تستخدم استراتيجيات مختلفة في تنقية الخلافة. التطبيقات التي تتطلب البروتين الهدف الأصلي ، قد يكون عرض موقع تشطر البروتيني لجعل إزالة الأنزيمية للعلامة ABDz1 11 ممكنة. وعلاوة على ذلك ، العلامة ABDz1 هو أول bispecific المجال بروتين صغير ومطوية صفها حتى الآن. انها فريدة من نوعها نظرا لأنه يوفر استراتيجية تنقية الذي يعتمد على التفاعلات هدف الدرجتين تقارب محددة. في المستقبل سيكون من المثير للاهتمام أن توسيع هذا المفهوم من خلال وضع علامات bispecific الرواية التي تحمل السطوح الملزمة الجديدة التي تتوافق مع الراتنجات الكروماتوغرافي متوفرة وغير مكلفة. على سبيل المثال ، عن طريق استبدال الأحماض الأمينية المتورطين في الألبومين ملزمة مع بقايا الأساسية ، وعلامة متوافق مع طقد يكون التبادل اللوني على تحقيقه. وقد ثبت ان مفهوم مماثل فعالة عن طريق الهندسة المسؤول عن Z – المجال لتوليد العلامات المعروفة باسم حمض Z 12 و 13 Z الأساسية المتوافقة مع أنيون وتبادل الأيونات الموجبة ، على التوالي.
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم تمويل هذا المشروع من قبل مؤسسة كنوت واليس والنبرغ ومجلس الأبحاث السويدي.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| E. coli RR1ΔM15 | American Type Culture Collection | 35102 |
| E. coli Rosetta (DE3) | Novagen | 70954 |
| Tryptic soy broth | Difco | 211822 |
| Yeast extract | Difco | 212720 |
| Vibra cell sonicator | Sonics and materials | – |
| HSA Sepharose | Pharmacia Biotech | Former product |
| HiTrap MabSelect SuRe | GE Healthcare | 11-0034-93 |
| HiTrap NHS-activated HP column | GE Healthcare | 17-0716-01 |
Referanslar
- Waugh, D. S. Making the most of affinity tags. Trends Biotechnol. 23, 316-320 (2005).
- Hedhammar, M. Protein engineering strategies for selective protein purification. CET. 28, 1315-1325 (2005).
- Porath, J. Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation. Nature. 258, 206-213 (1975).
- Linhult, M. Mutational analysis of the interaction between albumin-binding domain from streptococcal protein G and human serum albumin. Protein Sci. 11, 206-213 (2002).
- Nilsson, B. A synthetic IgG-binding domain based on staphylococcal protein. A. Protein Eng. 1, 107-113 (1987).
- Alm, T. A small bispecific protein selected for orthogonal affinity purification. Biotechnol. J. 5, 605-617 (2010).
- Nilsson, J. Multiple affinity domains for the detection, purification and immobilization of recombinant proteins. J. Mol. Recognit. 9, 585-594 (1996).
- Rüther, U. pUR 250 allows rapid chemical sequencing of both DNA strands of its inserts. Nucleic Acids Res. 10, 5765-5772 (1982).
- Kraulis, P. J. The serum albumin-binding domain of streptococcal protein G is a three-helical bundle: a heteronuclear NMR study. FEBS Lett. 378, 190-194 (1996).
- Hedhammar, M. Novel flow cytometry-based method for analysis of expression levels in E coli giving information about precipitated and soluble protein. J. Biotechnol. 119, 133-146 (2005).
- Carter, P. Site-specific proteolysis of fusion proteins. ACS Sympos. Ser. 427, 181-193 (1990).
- Hedhammar, M. Negatively charged purification tags for selective anion-exchange recovery. PEDS. 17, 779-786 (2004).
- Gräslund, T. Charge engineering of a protein domain to allow efficient ion-exchange recovery. Protein Eng. 13, 703-709 (2000).
