Este artículo describe un método versátil para crear células derivadas de los anillos de tejido celular por auto-ensamblaje. Las células musculares lisas sembradas en forma de anillo total de agarosa pozos y el contrato de forma sólida en tres dimensiones (3D) de los tejidos dentro de 7 días. A escala milimétrica los anillos de tejido son propicias para los ensayos mecánicos y servir de base para el montaje del tejido.
Cada año, cientos de miles de pacientes se someten a cirugía de revascularización coronaria en los Estados Unidos. 1 Aproximadamente un tercio de estos pacientes no han adecuado los buques cedentes autólogo debido a la progresión de la enfermedad o de la cosecha anterior. El objetivo de la ingeniería de tejidos vasculares es desarrollar una fuente alternativa adecuada para estos injertos. Además, la ingeniería tisular vascular pueden resultar útiles como modelos vivos vascular para estudiar las enfermedades cardiovasculares. Varios enfoques prometedores para los vasos sanguíneos de ingeniería han sido exploradas, con muchos estudios recientes centrados en el desarrollo y el análisis de los métodos basados en células. 2-5 Aquí, presentamos un método para rápidamente se auto-ensamblan las células en los anillos de tejido 3D que se pueden utilizar en modelo in vitro para los tejidos vasculares.
Para ello, las suspensiones de células de músculo liso se siembran en pocillos de fondo redondo anular agarosa. Las propiedades no adhesivo de la agarosa permitir ªlas células e para resolver, agregar y contrato de alrededor de un poste en el centro del pozo para formar un anillo de tejido cohesionado 6,7. Estos anillos pueden ser cultivadas durante varios días antes de la cosecha para la mecánica, el análisis fisiológicos, bioquímicos o histológicos. Hemos demostrado que estos anillos de tejidos derivados de células rendimiento a 100-500 kPa fuerza a la tracción 8, que excede el valor reportado para otras construcciones de ingeniería tisular vascular cultivadas por períodos similares (<30 kPa). 9,10 Nuestros resultados demuestran que la célula robusta derivados de la generación de tejido vascular del anillo se puede lograr en un corto período de tiempo, y ofrece la oportunidad para la evaluación directa y cuantitativa de los aportes de las células y la matriz de células derivadas de Desarrollo Limpio (MDL) de la estructura del tejido vascular y la función.
Recientemente, ha habido un creciente interés en la base de células o "andamio-menos" los métodos de la ingeniería de tejidos para hacer frente a algunas de las limitaciones de los enfoques basados en los andamios de ingeniería de tejidos. Dado que células derivadas de tejidos creados a partir de las células y la matriz que producen, que sí contienen mucho mayor densidad de células, no contienen materiales exógenos, y se puede hacer todo a partir de células humanas y de las proteínas. Injertos vasculares a partir de células humanas pueden alcanzar una resistencia mecánica considerable en la ausencia de andamios exógenos (por ejemplo, la presión de ruptura 3400 mmHg en comparación con 1600 mm de Hg para la vena safena humana) 12. Aunque basadas en células tejidos vasculares muestran mejoría en la densidad celular y la resistencia mecánica, métodos de fabricación más reciente (como "hoja de ingeniería con sede en" 3,4,12 o "bioprinting" 5,13) requieren largos períodos de cultivo (> 3 meses) o equipos especializados para la construcción de tejido 3D. El derivado de las células del tejido del anillo de metanfetaminaod descrito aquí permite una rápida celular de auto-ensamblaje para formar sólidas construcciones de tejido en 3D en un plazo corto de tiempo y sin el uso de equipo especializado.
Este protocolo se detalla el procedimiento que hemos desarrollado la creación de 2 mm de células derivadas de diámetro interior rata anillos de músculo liso de tejidos. En el presente ejemplo, los anillos de los tejidos se cultivaron durante 7 días (luego cultivaron durante 7 días adicionales para la fusión del anillo y la formación del tubo). Sin embargo, dos ratas mm (y humanos) de las células musculares lisas anillos pueden ser retirados de los pozos y son lo suficientemente coherente para el manejo (por ejemplo, transferir a tubos de silicona) tan pronto como un día después de la siembra de células. Además, los anillos de tejido sólido con distintos diámetros interiores (2, 4 y 6 mm) se pueden crear con este método, simplemente cambiando el diámetro del poste de la original del molde de policarbonato. 8 Recientemente también modificó el diseño de moldes de policarbonato para permitir que cinco de 2 pozos mm de sembrar para ser emitidos en una sola cámara multi-y agarosa, queutiliza menos PDMS y agarosa, y cabe en un pocillo de una placa de 6 pocillos (datos no mostrados). Los cambios en el diámetro del poste, el ancho de la siembra, así, el radio de curvatura de la parte inferior redondeada, el número de pozos de la siembra, o la profundidad de los pozos de siembra pueden ser modificados con sólo cambiar las especificaciones en el archivo de CAD para el CNC mecanizado del molde de policarbonato. Finalmente, un solo molde de policarbonato puede ser utilizado para fabricar un número ilimitado de plantillas de PDMS y PDMS cada plantilla se puede limpiar, autoclave y reutilizado docenas de veces.
Además de cambiar el tamaño de los anillos de tejido, hemos hecho los anillos de muchos tipos de células diferentes, incluyendo: SMC primarios de rata (aplicaciones de células, R354-05), principal SMC humanos la arteria coronaria (Lonza, CC-2583), la enseñanza primaria humanos fibroblastos dérmicos 11 (generoso regalo del doctor George Pines, WPI Departamento de Ingeniería Biomédica), fibroblastos de pulmón de rata (RFL-6, ATCC CCL-192), y las células madre mesenquimales (Lonza, PT-2501). Cada uno de estos tipos de células agregados y contratos de todo el centro de mensajes para formar anillos de tejido, aunque la organización celular, la composición de ECM, y las propiedades mecánicas de las construcciones varían para cada tipo de célula. Los parámetros de siembra para cada tipo de célula debe ser determinada empíricamente en función del tamaño de las células y su capacidad de agregar. Por lo tanto, si bien este sistema de creación de células derivadas de los anillos de tejido es extremadamente versátil, el protocolo puede necesitar pequeños ajustes para la formación de tejido óptima con diferentes tipos de células.
La geometría del tejido del anillo facilita una fácil carga y evaluación de las propiedades de los materiales de tejido de ensayo de tracción uniaxial, como se describe. También hay precedentes importantes para el uso de sangre de segmentos de anillos vaso para medir la contracción vascular y la función fisiológica. Estudios preliminares indican que células derivadas de los anillos de tejido puede ser montado en un dispositivo de miografía de alambre para la medición de la respuesta farmacológica ygeneración de la fuerza contráctil (datos no mostrados). En total, la capacidad de fabricar rápidamente auto-ensamblado de anillos de células para el análisis histológico, mecánicos, fisiológicos, bioquímicos y sugiere una nueva y poderosa herramienta que puede ser útil para el modelado de la estructura del tejido vascular y la función de la salud y la enfermedad.
The authors have nothing to disclose.
Los autores agradecen a Neil Whitehouse (WPI, Tienda Higgins de la máquina) por su ayuda con el mecanizado CNC. Además, nos gustaría agradecer a Adriana Hera (WPI Informática y el Centro de Comunicaciones) por su ayuda en MATLAB de programación, así como bebidas Kate y José Cotnoir (WPI Académico del Centro de Tecnología) para obtener ayuda con Camtasia. Sophie Burke y Becker Jacleen (WPI Académico del Centro de Tecnología) proporciona imágenes de vídeo adicional. Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud (R15 HL097332), la Universidad de Massachusetts Medical School-IPM iniciativa piloto de investigación, la American Heart Association (beca de investigación de pregrado a JZH), y el Instituto Politécnico de Worcester (Becas de Verano de Investigación de Pregrado a JZH e institucional la puesta en marcha de fondos para MWR).
Name of the reagent/equipment | Company | Catalog # |
---|---|---|
Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | Sylgard 184 |
Agarose | Lonza | 50000 |
DMEM | Mediatech | 15-017-CV |
Fetal Bovine Serum (FBS) | PAA | A05-201 |
Penicillin/Streptomycin | Mediatech | 30-002-CI |
Digital imaging system | DVT Corporation | Model 630 |
Uniaxial testing machine | Instron | ElectroPuls E1000 |
Edge Detection Software | DVT Corporation | Framework 2.4.6 |