자기 조립 셀룰러이 Biomechanical 분석 및 조직 공학을위한 셀 유래 조직 반지를 조작하는 감독

1. 세포 시딩 금형 제조 2mm의 중심지 포스트 직경 15, 둥근 바닥, 환상 우물을 만드는 폴리 카보 네이트의 1 / 2 "두께 부분을 밀링하여 시작합니다. 가공된 채널은 6 깊은 mm 넓은 3.75 mm입니다. 클린 및 폴리 카보 네이트 몰드를 건조 밀링 과정에서 모든 플라스틱 파편을 제거합니다. 모든 공기 방울을 제거하고 폴리 카보 네이트 몰드에 부어으로 치료 대리인, 가스를 제거하다하는 기지의 10시 1분 비율 (W / W)에 혼합 polydimethylsiloxane (PDMS). 가스를 제거하다 다시 남아있는 거품을 제거하고 4 시간 동안 60 ° C에서 오븐에 치료. 일단 치료, 조심스럽게 천천히 폴리 카보 네이트에서 물러나고하여 PDMS 템플릿을 제거 비누와 물로 씻어, 그리고 압력솥. 또한 2퍼센트 아가로 오스 (W / V) Dulbecco의 수정 독수리 중간 (DMEM)에 용해의 솔루션을 압력솥. 수준의 표면에 PDMS 템플릿을 놓고 용융 아가와 함께 기입 중앙 게시물 금형의 각에 첫번째 pipetting 아가로 오스 상승하고 주변 공간에 pipetting. 아가로 오스가 (약 15 분) 응고하도록 허용 후 PDMS에서 아가로 오스를 공개 금형을 반전. 우물의 각 주위에서 초과 아가로 오스 잘라, 그리고 12 – 잘 접시에 아가로 오스 우물을 넣으십시오. 2. 세포 배양 및 링 시딩 금형의 상단을 포함하지 않고, 아가로 오스 금형의 외부 주위 세포 문화 미디어 (10 % FBS, 1 % 페니실린 – 스트렙토 마이신과 DMEM) 추가합니다. 인큐베이터에있는 접시를 놓습니다하고 세포를 준비하는 동안 그들이 약 15 분 동안 평형 수 있습니다. 90 % 합류에서 쥐의 대동맥 평활근 세포 (rSMCs)을 trypsinize 및 5×10 6 세포 / ML의 농도에 resuspend. 각 잘하는 세포를 적용하는 원운동을 사용하여 고리 모양의 아가로 오스 우물의 각으로 세포 현탁액의 피펫 100 μL. 컨텐츠 "> 있는지 인큐베이터 선반이 수준 아르 확인 후 인큐베이터에서 접시를 배치하고 24 시간 동안 그대로 앉아하실 수 있습니다. 교류 매체는 이틀 이후 잘 주위에서 미디어를 aspirating하여 다시 작성 각 잘 때까지 아가로 오스는 잘 완전 침수입니다. 3. 조직 링 수확 및 두께 측정 문화의 결론에서, 중앙 게시물의 맨 위에 그것을 슬라이딩하여 아가로 오스 금형에서 반지를 제거합니다. 인산염과 작은 배양 접시에있는 반지를 놓고는 식염수 (PBS), 센터에게 샘플을 버퍼 및 디지털 이미징 시스템을 사용하여 이미지를 획득. 에지 검출을위한 이미지 분석 프로그램을 사용하고 둘레 약 4 위치 (상단, 하단, 왼쪽 및 오른쪽)에있는 고리의 두께를 측정합니다. 각 반지에 대한 의미 두께 값 (t)를 계산하고, 단면적을 계산하려면이 값을 사용(2π (T / 2) 2). 4. 반지의 기계적 시험 수평 위치에 인장 시험기를 (Instron EPS 1000)를 설정합니다. 1N ± 1mN로드 셀 및 사용자 지정 얇은 와이어를 그립 (스테인레스 스틸 와이어를 절곡하여 만든) 연결합니다. 두 얇은 와이어 그립에있는 반지 샘플을 탑재합니다. 5 MN 살갈퀴로드가 샘플에 적용 때까지 그립를 확장합니다. 단면적을 (두께 측정으로부터 계산)를 입력하고 게이지 길이를 기록합니다. 사전 사이클 8 배 10mm / 분 속도로 살갈퀴 하중 50 kPa 응력 사이의 반지. 미리주기 여덟째 후, 10mm / 분 실패로 당기십시오. 실패 한 측정에서 다음 40 % 강제의 감소로 기록됩니다. 각 반지 샘플은 궁극적인 인장 응력 (UTS)와 파괴 변형도를 측정하고 취득한 데이터의 최대 접선 계수 (MTM)를 계산합니다. 5. 조직 링으로sembly 조직 튜브를 조작하는 사용자 정의 튜브 소유자는 직사각형 단편 (2cm × 3 ㎝)과 원형 5cm 폴리 카보 네이트 디스크에서 가공됩니다. 이 홀더가 함께 끝장 수 있도록이 디스크를 통해 스레드 구멍을 드릴. 사용자 정의 튜브 홀더를 압력솥 다음 biosafety 캐비닛과 빈 배양 접시에있는 곳으로 전송할 수 있습니다. beveled 가장자리를 만들 수있는 각도로 1.9 mm 직경의 실리콘 튜브의 끝부분을 잘라 다음 실리콘 튜브를 압력솥에 외과 가위를 사용합니다. 튜브가 autoclaved되고있는 동안, 미디어 페트리 접시를 입력하십시오. 아가로 오스 우물에서 반지를 제거하고 미디어와 페트리 접시에 놓으십시오. 장소 사용하기 전에 그들을 엿먹일 수 같은 배양 접시에있는 실리콘 튜브를 autoclaved. 고리의 중심에 실리콘 튜브의 끝부분을 beveled 장소 부드럽게 실리콘 튜브에 반지를 슬라이드 집게를 사용하십시오. RI의 원하는 번호와 반복ngs. 부드럽게 튜브를 따라 양쪽 방향으로 연속 그들을 밀어 서로 접촉으로 반지를 슬라이드. 이 방법은 문화의 한 다음날 수확 고리 사용할 수 있습니다. 일단 고리는 폴리 카보 네이트 홀더 내에 실리콘 튜브를 정렬하고 함께 홀더의 두 부분을 나사, 탑재하고 있습니다. 100mm 배양 접시에있는 홀더를 놓고 55 ML 미디어를 추가합니다. 문화의 기간 동안 교환 언론 매 3 일. 조직 튜브를 제거하려면, 폴리 카보 네이트 홀더에서 실리콘 튜브를 출시하고 실리콘 튜브를 끄고 PBS 가득한 페트리 접시에 조직 튜브 슬라이드 집게를 사용합니다. 6. 대표 결과 : 프로토콜이 올바르게 수행되면, 세포는 24 시간 이내에 대응하는 금형 게시물의 직경과 동일 내부 직경 조직 반지를 형성 집계. 링 가장자리는 보통 외모에 부드럽고 (있다면 cultur수준의 표면에 에드), 전체 원주 주위의 두께를 균일하고 있습니다. 조직 반지는 취급하기 쉽고 후속 기계 및 histological 분석을 위해 자신의 우물 (Gwyther 외에 참조하십시오. 2011 년 8)에서 제거할 수 있습니다. 조직 링 형태, 매트릭스 구성과 기계적 성질이 씨앗 세포의 수와 유형에 따라 다릅니다. , 세포 유형을 다양한 조건을 퍼뜨리고, 문화의 길이로 만들어진 조직 링의 대표 결과는 표 1에 표시됩니다. 5×10 5 rSMCs에서 만든 두 mm ID의 고리는 우리 이전에 출판 2mm 고리 (6.6×10 5 rSMCs로 만든)에서 만든 반지보다 높은 UTS를 전시. 쥐의 세포, 인간의 평활근 세포 (hSMC)와 마찬가지로 8 즉시 조직을 형성하는 총체적 문화의 겨우 14 일 (데이터가 표시되지 않음) 후 콜라겐의 큰 금액을 포함 반지. 인간 mesenchymal 줄기 세포 (hMSC)도 집계와 응집 고리를 형성하지만, LAuniaxial 인장 시험의 초기 precycling의 단계에서 cked 기계적 강도와 부러 졌어요. N 핸드폰 번호 두께 (mm) 문화의 길이 (일) UTS (kPa) MTM (kPa) 파괴 변형 (㎜ / ㎜) rSMC 반지 6 660,000 0.94 ± 0.12 14 97 ± 30 497 ± 91 0.50 ± 0.08 rSMC 반지 4 500,000 0.53 ± 0.02 7 113 ± 8 189 ± 15 0.88 ± 0.05 hSMC 반지 3 750,000 0.51 ± 0.05 14 160 ± 30 270 ± 20 0.92 ± 0.08 hMSC 반지 3 750,000 0.40 ± 0.07 14 N / A N / A N / A 표 1. 문화 매개 변수와 다른 세포 유형, 시딩 농도, 그리고 문화에서 발생 기간이 2mm 반지의 기계적 성질을 보여주는 표. 그림 1. 조직 링 생성 과정 (A) 도식. 가공된 환상 웰스와 (B) 정의 폴리 카보 네이트 몰드. 중앙 포스트 지름은 2mm입니다. 그것은 폴리 카보 네이트 몰드 멀리 벗겨 이후 (C) PDMS 템플릿. (D) 집계 조직 반지는 2mm 포스트와 아가로 오스의 금형에 교양. PBS에서 (E) 2 mm 직경 조직 반지. 스케일 바 = 6mm (B, C)와 2mm (D, E). 그림 2. 응력 – 변형 곡선 produ 대표 플롯uniaxial 인장 시험에서 뭐하는거야.