В данной статье рассматривается универсальный метод для создания ячейки полученных кольца ткани сотовой самостоятельной сборки. Гладкие мышечные клетки посеяны в кольцевой агарозном скважин совокупности и контракт для формирования надежных трехмерных (3D) тканей в течение 7 дней. Миллиметрового масштаба кольца ткани способствуют механические испытания и служат в качестве строительных блоков для сборки ткани.
Каждый год сотни тысяч пациентов проходят аортокоронарного шунтирования в США 1. Примерно треть этих пациентов нет подходящих доноров аутологичных судов из-за прогрессирования заболевания или предыдущего урожая. Цель сосудистой тканевой инженерии является разработка подходящего альтернативного источника для этих шунтов. Кроме того, разработаны сосудистой ткани могут оказаться полезными в качестве живых сосудистой модели для изучения сердечно-сосудистых заболеваний. Несколько перспективных подходов к судам инженерных крови были изучены, и многие недавние исследования с акцентом на развитие и анализа клеточных методов. 2-5 Здесь мы представляем метод быстро самоорганизуются клеток в 3D кольца ткань, которая может быть использована в пробирке для моделирования сосудистой ткани.
Чтобы сделать это, суспензии клеток гладкой мускулатуры высевают в круглым дном кольцевой агарозном скважин. Не-адгезионные свойства позволяют агарозном йэлектронной клетки на поселение, агрегировать и контракт вокруг поста в центре и сформировать сплоченную кольцо ткани. 6,7 Эти кольца можно культивировать в течение нескольких дней перед сбором урожая для механических, физиологических, биохимических, или гистологического анализа. Мы показали, что эти клеточные полученные кольца ткань выход на 100-500 кПа предел прочности на растяжение 8, которая превышает стоимость зарегистрированы и в других тканях инженерных конструкций сосудистых культивировали в течение аналогичного длительности (<30 кПа). 9,10 Наши результаты показывают, что надежная ячейка полученных сосудистой поколения кольцо ткани может быть достигнуто в течение короткого периода времени, и дает возможность для прямого и количественная оценка вклада клеток и клеточных производных матрицы (МЧР) в сосудистой структуры тканей и функции.
В последнее время наблюдается повышенный интерес к клеточной или "строительные леса-менее" методы тканевой инженерии для решения некоторых из ограничений эшафот подходов, основанных на тканевой инженерии. Учитывая, что клетка полученные ткани, созданные из клеток и матрицей они производят, они по своей природе содержат гораздо более высокой плотности клетки, не содержащие экзогенные материалов, и могут быть изготовлены полностью из человеческих клеток и белков. Протезы сосудов из человеческих клеток может достичь существенной механической прочностью при отсутствии экзогенных лесов (например, взрыв давлением 3400 мм рт.ст. по сравнению с 1600 мм рт.ст. для человека подкожных вен) 12. Хотя клеточной сосудистой ткани выставку улучшения клеточной плотности и механической прочности, большинство современных методов производства (такие, как "лист основе техники" 3,4,12 или "bioprinting" 5,13) требуются длительные периоды времени в культуре (> 3 месяцев) или специализированное оборудование для строительства 3D ткани. Ячейки полученных тканей кольцом методамиод, описанные здесь позволяет быстро сотовой самосборки для формирования надежной конструкции 3D-ткани в течение короткого периода времени и без использования специального оборудования.
Этот протокол подробно процедура, разработанная нами для создания 2 мм внутреннего диаметра крысы гладкой мышечной клетки полученные кольца ткани. В настоящее время, например, ткань кольца культивировали в течение 7 дней (затем культивировали в течение дополнительных 7 дней для синтеза кольца и трубки образования). Тем не менее, 2 мм крысы (и человека) гладкие кольца мышечных клеток могут быть удалены из скважин и сплоченной достаточно для обработки (например, передача на силиконовых трубок) уже на следующий день после посева ячейки. Кроме того, прочная ткань кольца с различным внутренним диаметром (2, 4 и 6 мм) могут быть созданы с помощью этого метода, просто изменив сообщение диаметр оригинальной формы из поликарбоната. 8 Кроме того, мы недавно изменили дизайн поликарбоната плесень включить пять 2 мм посева скважин должны быть поданы в одном мульти-и агарозном камеры,использует меньше PDMS и агарозы, и вписывается в одну лунку 6-луночного планшета (данные не представлены). Изменения в штатном диаметре, ширина посева хорошо, радиус кривизны округлый низ, номер посева скважин, или глубина посева скважин могут быть изменены только путем изменения спецификаций в файл CAD для ЧПУ обработка форм поликарбоната. Наконец, единственной формы, поликарбонат может быть использован для изготовления неограниченное число шаблонов PDMS, и каждый шаблон PDMS могут быть очищены, автоклавного и повторно использовать в десятки раз.
В дополнение к изменению размера ткани кольца, мы сделали кольца из разных типов клеток, в том числе: первичный ГМК крысы (Cell приложения, R354-05), первичных человеческих коронарной артерии ГМК (Lonza, СС-2583), первичных человеческих кожных фибробластов 11 (щедрый подарок доктора Джорджа Pins, WPI кафедры биомедицинской инженерии), фибробластов легких у крыс (РКИ-6, АТСС CCL-192), и мезенхимальных стволовых клеток (Lonza, ПТ-2501). Каждый из этих типов клеток агрегатов и контракты вокруг центра сообщений для формирования тканей кольца, хотя клеточной организации, ECM состава и механических свойств конструкции изменяются для каждого типа клеток. Посев параметры для каждого типа клеток должны быть эмпирически определяется на основе размера клеток и их способность к агрегации. Поэтому, хотя эта система создания ячейки полученных кольца ткани чрезвычайно гибок, протокол может потребоваться некоторые коррективы для оптимального формирование ткани с различными типами клеток.
Геометрия тканей кольцо облегчает погрузку и оценки свойств тканевого материала при одноосном тестирования на разрыв, как описано. Существует также существенный прецедент для использования крови сегментов судна кольцо для измерения сосудистых сокращений и физиологические функции. Предварительные исследования показывают, что клетка полученные кольца ткани могут быть установлены на устройстве myograph провод для измерения фармакологической реакции исократительной формирование сил (данные не представлены). В целом, способность быстро изготовить самоорганизующихся кольца ячейки для гистологического, механические, физиологические и биохимические анализы предлагает новый мощный инструмент, который может быть полезным для моделирования сосудистой структуры тканей и функции в норме и патологии.
The authors have nothing to disclose.
Авторы выражают благодарность Нил Уайтхаус (ИЗВ, Хиггинс Machine Shop) за его помощь в обработке CNC. Кроме того, мы хотели бы поблагодарить Адриана Гера (ИЗВ вычислений и связи Центр) за помощь в MATLAB программирования, а также напитки и Кейт Джозеф Cotnoir (ИЗВ Академический технический центр) за помощь в Camtasia. Софи Берк и Jacleen Беккер (WPI Академический технический центр), при условии дополнительного видеоматериалы. Эта работа финансировалась Национальным институтом здоровья (R15 HL097332), Медицинской школы Университета Массачусетса-WPI Pilot Исследовательская инициатива, Американской ассоциации сердца (для студентов стипендию исследований JZH) и Вустер политехнического института (лето Бакалавриат стипендий для исследований JZH и институциональных стартовый капитал для MWR).
Name of the reagent/equipment | Company | Catalog # |
---|---|---|
Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | Sylgard 184 |
Agarose | Lonza | 50000 |
DMEM | Mediatech | 15-017-CV |
Fetal Bovine Serum (FBS) | PAA | A05-201 |
Penicillin/Streptomycin | Mediatech | 30-002-CI |
Digital imaging system | DVT Corporation | Model 630 |
Uniaxial testing machine | Instron | ElectroPuls E1000 |
Edge Detection Software | DVT Corporation | Framework 2.4.6 |