Este artigo descreve um método versátil para criar anéis de células derivadas do tecido celular por auto-montagem. Células musculares lisas semeadas em forma de anel-agarose agregado poços e contrato de forma robusta em três dimensões (3D) tecidos dentro de 7 dias. Anéis milímetro escala de tecido são conducentes a testes mecânicos e servem como blocos de construção para a montagem dos tecidos.
Cada ano, centenas de milhares de pacientes submetidos a cirurgia de revascularização do miocárdio nos Estados Unidos 1. Aproximadamente um terço destes pacientes não têm adequado navios dadores autólogo devido à progressão da doença ou safra anterior. O objetivo da engenharia de tecidos vasculares é desenvolver uma fonte alternativa adequada para estas pontes. Além disso, o tecido vascular engenharia pode revelar-se útil como modelos vivos vascular para estudar doenças cardiovasculares. Várias abordagens promissoras para os vasos sanguíneos de engenharia têm sido exploradas, com muitos estudos recentes com foco no desenvolvimento e análise de métodos baseados em células. 2-5 Aqui, apresentamos um método para rapidamente auto-montar células em anéis de tecido 3D que pode ser usado em vitro para modelar os tecidos vasculares.
Para fazer isso, suspensões de células musculares lisas são semeados no fundo redondo de anular agarose poços. As propriedades não-adesivo do agarose permitem ªcélulas e para resolver, agregar e contrato em torno de um posto no centro do poço para formar um anel de tecido coeso. 6,7 Estes anéis podem ser cultivadas por vários dias antes da colheita para a mecânica, análise fisiológica, bioquímica ou histológica. Nós mostramos que estes anéis de células derivadas de tecidos de rendimentos na resistência à tração 100-500 kPa final 8, que excede o valor reportado para outras construções de tecido vascular engenharia cultivadas por períodos semelhantes (<kPa 30). 9,10 Nossos resultados demonstram que a célula robusta derivados de geração de anel vascular do tecido pode ser alcançada dentro de um curto período de tempo, e oferece a oportunidade para avaliação direta e quantitativa das contribuições de células e de células derivadas de matriz (MDL) para a estrutura do tecido vascular e função.
Recentemente, tem havido um crescente interesse na célula-base ou "scaffold-less" métodos de engenharia de tecidos para tratar de algumas das limitações do andaime abordagens baseadas em engenharia de tecidos. Uma vez que células derivadas de tecidos são criados a partir de células e da matriz que produzem, eles inerentemente contêm densidades celulares muito maior, não contêm materiais exógenos, e pode ser feita inteiramente a partir de células humanas e proteínas. Enxertos vasculares feita a partir de células humanas podem atingir resistência mecânica substanciais na ausência de andaimes exógenas (por exemplo, pressões de ruptura 3400 mmHg em comparação a 1600 mmHg para veias safenas humanas) 12. Embora baseada em células de tecido vascular apresentam densidade celular melhorada e resistência mecânica, métodos de fabricação mais atuais (como "folha-base engenharia" 3,4,12 ou "bioprinting" 5,13) requerem períodos cultura extensa (> 3 meses) ou equipamentos especializados para a construção do tecido 3D. O anel de tecido derivadas de células-method descrito aqui permite rápida celulares auto-montagem para formar robusto constrói tecido 3D dentro de um curto período de tempo e sem o uso de equipamentos especializados.
Este protocolo detalha o procedimento foi desenvolvido para criar dois milímetros de diâmetro interior de ratos células derivadas do tecido do músculo liso anéis. No presente exemplo, os anéis de tecido foram cultivados por 7 dias (então cultivadas por mais sete dias para a fusão de anel e formação do tubo). No entanto, dois ratos mm (e humanos) anéis de células musculares lisas podem ser removidas dos poços e coesa o suficiente para o tratamento (por exemplo, transferir para tubos de silicone) tão cedo como um dia após a semeadura de células. Além disso, os anéis de tecido robusto com diferentes diâmetros internos (2, 4 e 6 mm) podem ser criadas com este método, simplesmente alterando o diâmetro post do molde de policarbonato original. 8 Nós também recentemente modificado o projeto de moldes de policarbonato para habilitar cinco dois milímetros poços semeadura para ser lançado em um único multi-câmara de agarose bem, o queusa menos PDMS e agarose, e se encaixa em um poço de uma placa de 6 poços (dados não mostrados). Alterações no diâmetro post, a largura da semeadura bem, o raio de curvatura da parte inferior arredondada, o número de poços de semeadura, ou a profundidade dos poços semeadura podem ser modificadas simplesmente mudando as especificações no arquivo CAD para CNC usinagem do molde de policarbonato. Finalmente, um molde de policarbonato único pode ser usado para fabricar um número ilimitado de modelos PDMS, e cada modelo PDMS podem ser limpos, autoclavados e reutilizados dezenas de vezes.
Além de alterar o tamanho dos anéis de tecido, fizemos anéis de muitos tipos de células diferentes, incluindo: SMCs rato primária (Applications Cell, R354-05), humanos primários SMCs arterial coronariana (Lonza, CC-2583), humanas primárias fibroblastos dérmicos 11 (dom generoso de Pinos Dr. George, WPI Departamento de Engenharia Biomédica), fibroblastos de pulmão de rato (RFL-6, ATCC CCL-192), e as células-tronco mesenquimais (Lonza, PT-2501). Cada um dos tipos de célula destes agregados e contratos em todo o posts centro para formar anéis de tecido, embora a organização celular, composição ECM, e propriedades mecânicas das construções variam para cada tipo de célula. Os parâmetros de semeadura para cada tipo de célula deve ser empiricamente determinada com base no tamanho das células e sua capacidade de agregar. Portanto, enquanto este sistema de criação de anéis de células derivadas de tecido é extremamente versátil, o protocolo pode precisar de pequenos ajustes para a formação de tecido ideal com diferentes tipos de células.
Geometria do anel de tecido facilita o carregamento fácil e avaliação das propriedades do material tecido por testes de tração uniaxial, conforme descrito. Há também precedentes substancial para o uso segmentos sangue anel navio para medir a contração vascular e função fisiológica. Estudos preliminares indicam que os anéis de células derivadas de tecido pode ser montado em um dispositivo myograph fio para a medição da capacidade de resposta farmacológica egeração de força contrátil (dados não mostrados). Ao todo, a capacidade de rapidamente fabricar anéis de auto-montagem de células para análise histológica, mecânicos, fisiológicos, bioquímicos e sugere uma nova e poderosa ferramenta que pode ser útil para a modelagem de estrutura do tecido vascular e função na saúde e na doença.
The authors have nothing to disclose.
Os autores agradecem Neil Whitehouse (WPI, Higgins Loja Machine) por sua ajuda com usinagem CNC. Além disso, gostaríamos de agradecer a Adriana Hera (WPI Computing e Communications Center) por sua ajuda com MATLAB programação, bem como bebidas e Kate Cotnoir Joseph (WPI Acadêmica Centro de Tecnologia) para obter assistência com Camtasia. Sophie Burke e Jacleen Becker (WPI Acadêmica Centro de Tecnologia), desde imagens de vídeo suplementar. Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health (R15 HL097332), o UMass Medical School-WPI Pilot Research Initiative, a American Heart Association (bolsa de pesquisa de graduação para JZH), e Instituto Politécnico de Worcester (Verão Bolsa de Investigação para JZH Graduação e institucionais start-up fundos para MWR).
Name of the reagent/equipment | Company | Catalog # |
---|---|---|
Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | Sylgard 184 |
Agarose | Lonza | 50000 |
DMEM | Mediatech | 15-017-CV |
Fetal Bovine Serum (FBS) | PAA | A05-201 |
Penicillin/Streptomycin | Mediatech | 30-002-CI |
Digital imaging system | DVT Corporation | Model 630 |
Uniaxial testing machine | Instron | ElectroPuls E1000 |
Edge Detection Software | DVT Corporation | Framework 2.4.6 |