Diretto Cellular Self-Assembly di fabbricare Cell-Derived Anelli tessuto per l'analisi biomeccanica e di ingegneria dei tessuti

1. Cellula semina fabbricazione dello stampo Iniziare mediante fresatura da un 1 / 2 "pezzo spesso di policarbonato per creare 15, a fondo tondo, pozzi anulare con diametro del perno di centraggio di 2 mm. I canali fresato sono 6 mm di profondità e 3,75 millimetri di larghezza. Pulire e asciugare lo stampo in policarbonato per rimuovere eventuali residui di plastica dal processo di fresatura. Mix polidimetilsilossano (PDMS) con un rapporto 10:1 (w / w) di base a catalizzatore, Degas per rimuovere tutte le bolle d'aria, e versare sopra lo stampo in policarbonato. Degas di nuovo per rimuovere eventuali bolle rimanenti, e la cura in forno a 60 ° C per 4 ore. Una volta indurito, rimuovere con attenzione il modello da PDMS lentamente peeling dal policarbonato, lavare con acqua e sapone, e autoclave. Anche autoclave una soluzione di agarosio per cento due (w / v) disciolto in Dulbecco modificato (DMEM). Posizionare il modello PDMS su una superficie piana e riempire con fuso aga è aumentato del primo pipettaggio agarosio in ciascuno dei stampi posta al centro, e poi pipettaggio nello spazio intorno ad esso. Lasciare solidificare l'agarosio (circa 15 minuti), poi capovolgere lo stampo per liberare l'agarosio dal PDMS. Tagliare l'eccesso di agarosio di tutto ognuno dei pozzi, i pozzi e il luogo di agarosio in 12-pozzetti. 2. Coltura cellulare e semina anello Aggiungi coltura cellulare media (DMEM con 10% FBS e 1% penicillina-streptomicina) intorno alla parte esterna dello stampo agarosio, senza coprire la parte superiore degli stampi. Posizionare le piastre nell'incubatore e permettere loro di equilibrare per circa 15 minuti mentre preparate le cellule. Al 90% confluenza, trypsinize topo cellule muscolari lisce aortiche (rSMCs) e risospendere ad una concentrazione di 5×10 6 cellule / ml. Pipettare 100 l di sospensione cellulare in ciascuno dei anulare agarosio pozzi, con un movimento circolare per applicare le cellule in ogni pozzetto. contenuto "> Assicurarsi che gli scaffali sono incubatore livello, quindi posizionare le piastre nell'incubatrice e permettere loro di riposare per 24 ore. medium Cambio ogni due giorni successivi aspirando i media di tutto il bene, e ri-riempire ogni bene fino alla agarosio bene è completamente sommerso. 3. Tessuto raccolta anello e misure di spessore A conclusione della cultura, rimuovere l'anello dallo stampo agarosio facendolo scorrere sopra la parte superiore del montante centrale. Posizionare l'anello in una piccola scatola di Petri con tampone fosfato (PBS), centro del campione, e acquisire un'immagine utilizzando un sistema di imaging digitale. Utilizzare un programma di analisi delle immagini per il rilevamento dei bordi e misurare lo spessore dell'anello in 4 posizioni (alto, basso, sinistra e destra) lungo la sua circonferenza. Calcolare il valore medio spessore (t) per ogni singolo anello, e usare questo valore per calcolare la sezione trasversale(2π (t / 2) 2). 4. Prove meccaniche di anelli Impostare la macchina di prova a trazione (Instron EPS 1000) in posizione orizzontale. Collegare un 1N ± 1mn cella di carico e personalizzati impugnature filo sottile (creato da piegare filo di acciaio inossidabile). Montare l'anello di campione sulle due impugnature filo sottile. Estendere le prese fino a 5 mN carico tara è applicata al campione. Inserire la sezione trasversale (in base a misurazioni di spessore) e registrare il tratto utile. Pre-ciclo gli anelli 8 volte tra il carico di stress tara e 50 kPa ad una velocità di 10 mm / min. Dopo l'ottavo pre-ciclo, tirare al fallimento a 10 mm / min. Il fallimento è notato come una diminuzione della forza del 40% da una misura all'altra. Per ogni campione anello, misurare lo sforzo finale trazione (UTS) e tensioni fallimento e calcolare il massimo tangente modulo (MTM) a partire dai dati acquisiti. 5. Tessuto anellotaggio per fabbricare tubi di tessuto Portaprovette personalizzati sono lavorati da rotondo 5 centimetri dischi di policarbonato con ritagli rettangolari (2 cm x 3 cm). Praticare i fori filettati con questi dischi per consentire a due titolari di essere avvitati insieme. Autoclave i titolari tubo personalizzato e quindi il trasferimento al mobile biosicurezza e metterlo in un piatto vuoto Petri. Usare le forbici chirurgiche per tagliare le estremità dei tubi di 1,9 mm di diametro in silicone con un angolo per creare bordi smussati, e poi in autoclave i tubi in silicone. Mentre i tubi sono stati sterilizzati in autoclave, riempire una piastra di Petri con i media. Rimuovere gli anelli dai pozzi agarosio e metterli nella scatola di Petri con i media. Luogo in autoclave i tubi di silicone nello stesso piatto di Petri per bagnare prima dell'uso. Utilizzare pinze per mettere un fine smussata di un tubo di silicone al centro di un anello e far scorrere l'anello sul tubo in silicone. Ripetere con il numero desiderato di riNGS. Far scorrere gli anelli in contatto uno con l'altro da delicatamente spingendo successivamente in entrambe le direzioni lungo il tubo. Questo metodo può essere utilizzato per gli anelli raccolti dopo un solo giorno in coltura. Una volta che gli anelli sono montati, allineare i tubi di silicone all'interno della titolari policarbonato e avvitare le due parti del titolare insieme. Posizionare il supporto in un piatto di 100 mm di Petri e aggiungere 55 ml multimediali. Scambio dei media ogni 3 giorni per la durata della cultura. Per rimuovere i tubi di tessuto, rilasciare i tubi in silicone dal supporto in policarbonato e utilizzare pinze per far scorrere i tubi di tessuto dal tubo in silicone e in una piastra di Petri riempite con PBS. 6. Rappresentante dei risultati: Quando il protocollo è eseguita correttamente, le cellule si aggregano formando anelli di tessuto con un diametro interno uguale al diametro del perno stampo corrispondente entro 24 ore. I bordi lisci ad anello sono di solito in apparenza e (se cultured su una superficie piana), sono di spessore uniforme lungo l'intero perimetro. Gli anelli di tessuto sono facili da gestire e possono essere rimossi dai loro pozzi per le successive analisi meccaniche e istologiche (v., in Gwyther et al. 2011, 8). Anello morfologia del tessuto, la composizione della matrice, e le proprietà meccaniche variano a seconda del numero e del tipo di cellule inseminate. Risultati rappresentativi da anelli di tessuto a base di diversi tipi di cellule, semina le condizioni, e la lunghezza della cultura sono riportati nella tabella 1. Due anelli mm ID creato da 5×10 5 rSMCs esibito un carico di rottura superiore a quello anelli creati dalla nostra precedentemente pubblicato con 2 anelli mm (fatto da 6.6×10 5 rSMCs). Simili alle cellule di ratto, cellule muscolari lisce (HSMC) 8 facilmente aggregate per formare il tessuto Anelli, che conteneva una grande quantità di collagene dopo soli 14 giorni in coltura (dati non riportati). Cellule staminali mesenchimali (hMSC) anche aggregati e formano anelli coesa, ma lacked resistenza meccanica e si è rotto durante le fasi iniziali di precycling prove di trazione uniassiale. n Numero di cellule Spessore (mm) Lunghezza della cultura (giorni) UTS (kPa) MTM (kPa) Il mancato ceppo (mm / mm) rSMC anelli 6 660.000 0,94 ± 0,12 14 97 ± 30 497 ± 91 0,50 ± 0,08 rSMC anelli 4 500.000 0,53 ± 0,02 7 113 ± 8 189 ± 15 0,88 ± 0,05 HSMC anelli 3 750.000 0,51 ± 0,05 14 160 ± 30 270 ± 20 0,92 ± 0,08 hMSC anelli 3 750.000 0,40 ± 0,07 14 N / A N / A N / A Tabella 1. Tabella che mostra i parametri della cultura e delle proprietà meccaniche dei 2 anelli millimetri generate da diversi tipi di cellule, le concentrazioni di semina, e durate la cultura. Figura 1. (A) Schema del processo di generazione dei tessuti anello. (B) Personalizzato stampo in policarbonato con fresata pozzi anulare. Diametri postale centrale sono 2 mm. (C) PDMS modello dopo che è stato staccato dallo stampo in policarbonato. (D) anello di tessuto aggregati in coltura in uno stampo agarosio con un post 2 mm. (E) Due millimetri di diametro anello di tessuto in PBS. Barre di scala = 6 mm (B, C) e 2 mm (D, E). Figura 2. Trama rappresentante della curva produttori sforzo-deformazioneced da prove di trazione uniassiale.