Directed Cellular Self-Assembly to Cell-Derived Tissue Ringe für biomechanische Analyse und Tissue Engineering Fabricate

1. Zellaussaat Formenbau Beginnen Sie mit dem Fräsen einer 1 / 2 "dickes Stück aus Polycarbonat bis 15, mit rundem Boden, ringförmigen Vertiefungen mit einer Mittelsäule Durchmesser von 2 mm zu schaffen. Die gefrästen Kanäle sind 6 mm tief und 3,75 mm breit. Reinigen und trocknen Sie das Polycarbonat Schimmel entfernen Sie alle Kunststoff-Ablagerungen aus dem Mahlvorgang. Mix Polydimethylsiloxan (PDMS) bei einem Verhältnis von 10:1 (w / w) von Base zu Härter, Degas, um alle Luftblasen zu entfernen, und gießen Sie auf das Polycarbonat Form. Degas wieder entfernen Sie alle verbleibenden Blasen und Heilung in den Ofen bei 60 ° C für 4 Stunden. Einmal ausgehärtet, entfernen Sie vorsichtig die PDMS-Vorlage durch langsames Abziehen es weg von der Polycarbonat, mit Wasser und Seife waschen, und Autoklaven. Auch Autoklaven eine Lösung von zwei Prozent Agarose (w / v) gelöst in Dulbecco modifiziertem Eagle Medium (DMEM). Legen Sie die PDMS-Vorlage auf eine ebene Fläche und füllen mit geschmolzenem aga stieg um ersten Pipettierung Agarose in jedem der Mitte nach Schimmel, und dann Pipettieren in den Raum um ihn herum. Lassen Sie die Agarose sich verfestigen (ca. 15 Minuten), dann invertieren die Form der Agarose aus dem PDMS freizugeben. Cut über Agarose aus der ganzen jede der Vertiefungen und legen Sie die Agarose Bohrungen in 12-Well-Platten. 2. Zellkultur-und Ring-Aussaat Add Zellkulturmedien (DMEM mit 10% FBS und 1% Penicillin-Streptomycin) um die Außenseite der Agarose Form, ohne die Oberseite der Formen. Legen Sie die Platten in den Inkubator und es ihnen ermöglichen, für ca. 15 Minuten ausgleichen, während Sie die Zellen herzustellen. Bei 90% Konfluenz trypsinize Rattenaorta glatten Muskelzellen (rSMCs) und resuspendieren in einer Konzentration von 5×10 6 Zellen / ml. Je 100 ul Zellsuspension in jede der ringförmigen Agarose Brunnen, mit kreisenden Bewegungen, um Zellen in jede Vertiefung gelten. content "> Stellen Sie sicher, Inkubator Regale sind Ebene, dann die Platten in den Inkubator und ihnen erlauben, sitzen 24 Stunden lang ungestört. Exchange Medium alle zwei Tage danach durch Ansaugen der Medien aus der ganzen gut, und re-Füllung in jede Vertiefung, bis die Agarose gut ist völlig untergetaucht. 3. Tissue Ring Ernte-und Dickenmessung Am Ende der Kultur, entfernen Sie den Ring aus der Agarose Form, indem Sie ihn über den Rand des Zentrums zu posten. Legen Sie den Ring in einer kleinen Petrischale mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS), in der Mitte der Probe, und erwerben Sie ein Bild mit einer digitalen Imaging-System. Verwenden Sie eine Bildanalyse-Programm für die Kantenerkennung und messen die Dicke des Rings in 4 Positionen (oben, unten, links und rechts) um seinen Umfang. Berechnen Sie die mittlere Dicke Wert (t) für jeden einzelnen Ring, und verwenden Sie diesen Wert auf die Querschnittsfläche berechnen(2π (t / 2) 2). 4. Mechanische Prüfung von Ringen Richten Sie die Zugprüfmaschine (Instron EPS 1000) in die horizontale Position. Bringen Sie eine 1N ± 1mN Wägezelle und benutzerdefinierte dünnen Draht Griffe (erstellt durch Biegen Edelstahlseile). Montieren Sie den Ring Probe auf den beiden dünnen Draht Griffe. Verlängern Sie die Griffe bis zu einem 5 mN Taralast auf die Probe aufgebracht wird. Geben Sie die Querschnittsfläche (berechnet aus Dickenmessungen) und notieren Sie die Messlänge. Pre-Zyklus der Ringe 8-mal zwischen den Taralast und 50 kPa Stress mit einer Geschwindigkeit von 10 mm / min. Nach dem achten pre-Zyklus, zum Scheitern zu ziehen bei 10 mm / min. Das Scheitern ist eine Abnahme der Kraft um 40% von einer Messung zur nächsten vermerkt. Für jeden Ring Probe messen die Zugfestigkeit (UTS) und Bruchdehnung und berechnen Sie den maximalen Tangente Modul (MTM) aus den gewonnenen Daten. 5. Tissue-Ring alssammlung zu fertigen Gewebe Rohre Benutzerdefinierte Rohrhalter aus Runde 5 cm Polycarbonat Scheiben mit rechteckigen Aussparungen (2 cm x 3 cm) bearbeitet. Drill Gewindebohrungen durch diese Scheiben zu ermöglichen zwei Halterungen miteinander verschraubt werden. Autoclave die benutzerdefinierte Gefäßhalter und dann Transfer zum Biosicherheitswerkbank und in eine leere Petrischale. Verwenden chirurgische Schere an den Enden von 1,9 mm Durchmesser Silikonschläuche in einem Winkel zur abgeschrägten Kanten zu schaffen geschnitten und anschließend autoklavieren Silikonschläuche. Während die Rohre sind autoklaviert wird, füllen eine Petrischale mit Medien. Entfernen Sie die Ringe von der Agarose Brunnen und legen Sie sie in der Petrischale mit den Medien. Ort autoklaviert Silikonschläuche in der gleichen Petrischale, um sie vor dem Gebrauch nass. Verwenden einer Pinzette, um eine abgeschrägte Ende einer Silikon-Schlauch in der Mitte einen Ring Platz und schieben Sie den Ring auf den Silikonschlauch. Wiederholen Sie die gewünschte Anzahl von rings. Schieben Sie die Ringe in Kontakt miteinander, indem Sie ihn sie nacheinander in beiden Richtungen entlang der Röhre. Diese Methode kann für Ringe nach nur einem Tag in Kultur geerntet werden. Sobald Ringe befestigt sind, richten Sie Silikonschläuche in der Polycarbonat-Halterungen ein und die beiden Teile der Halterung zusammen. Setzen Sie den Halter in eine 100 mm Petrischale und fügen 55 mL Medien. Börse Medien alle 3 Tage für die Dauer der Kultur. Zum Entfernen des Gewebes Rohre, lassen Sie die Silikonschläuche aus dem Polycarbonat Halter und Pinzette verwenden, um das Gewebe Rohre aus dem Silikon-Schlauch und in eine Petrischale mit PBS gefüllte Rutsche. 6. Repräsentative Ergebnisse: Wenn das Protokoll korrekt durchgeführt wird, aggregierte Zellen, Gewebe-Ringe mit einem inneren Durchmesser gleich dem Durchmesser der entsprechenden Form post innerhalb von 24 Stunden zu bilden. Die Kanten des Rings sind in der Regel in Erscheinung glatt und (wenn cultured auf einer ebenen Fläche), sind in der Dicke um den gesamten Umfang einheitlich. Das Gewebe Ringe sind einfach zu handhaben und kann aus ihren Brunnen für nachfolgende mechanische und histologische Analyse (siehe in Gwyther et al., 2011 8) entfernt werden. Tissue Ring Morphologie, Matrix Zusammensetzung und mechanischen Eigenschaften variieren je nach Anzahl und Art der Zellen ausgesät. Repräsentative Ergebnisse aus Gewebe Ringe aus unterschiedlichen Zelltypen, Aussaat Bedingungen, und die Kultur der Länge hergestellt, sind in Tabelle 1 dargestellt. Zwei mm ID Ringe von 5×10 5 rSMCs erstellt zeigten eine höhere UTS als Ringe aus unserer bisher veröffentlichten 2 mm Ringe (aus 6.6×10 5 rSMCs) erstellt. 8 Ähnlich wie bei Ratten-Zellen, humanen glatten Muskelzellen (HSMC) leicht aggregiert, um Gewebe zu bilden Ringe, die eine große Menge von Kollagen nach nur 14 Tagen in Kultur (Daten nicht gezeigt) enthalten. Humane mesenchymale Stammzellen (hMSC) auch aggregiert und bilden geschlossene Ringe, sondern lacked mechanische Festigkeit und brach während der ersten precycling Phasen der einachsigen Zugversuch. n Die Zellzahl Dicke (mm) Länge der Kultur (Tage) UTS (kPa) MTM (kPa) Bruchdehnung (mm / mm) rSMC Ringe 6 660.000 0,94 ± 0,12 14 97 ± 30 497 ± 91 0,50 ± 0,08 rSMC Ringe 4 500.000 0,53 ± 0,02 7 113 ± 8 189 ± 15 0,88 ± 0,05 HSMC Ringe 3 750.000 0,51 ± 0,05 14 160 ± 30 270 ± 20 0,92 ± 0,08 hMSC Ringe 3 750.000 0,40 ± 0,07 14 N / A N / A N / A Tabelle 1. Tabelle zeigt die Kultur Parameter und mechanischen Eigenschaften von 2 mm Ringe aus unterschiedlichen Zelltypen, Aussaat-Konzentrationen und Kultur Dauer erzeugt. Abbildung 1. (A) Schematische Darstellung des Gewebes Ring Generierung. (B) Custom Polycarbonat Form mit gefrästen ringförmigen Vertiefungen. Zentrale Poststelle Durchmesser 2 mm. (C) PDMS-Vorlage, nachdem sie weg war aus dem Polycarbonat Form geschält. (D) Aggregierte Gewebe Ring in einer Agarose-Form mit einer 2 mm post kultiviert. (E) Zwei mm Durchmesser Gewebe Ring in PBS. Maßstabsbalken = 6 mm (B, C) und 2 mm (D, E). Abbildung 2. Representative Grundstück von Spannungs-Dehnungs-Kurve produced aus einachsigen Zugversuch.