Dit artikel schetst een veelzijdige methode om uit de cel afkomstige weefsel ringen te creëren door cellulaire zelf-assemblage. Gladde spiercellen gezaaid in de ring-vormige agarose putten aggregaat en contract tot robuuste driedimensionale (3D) weefsels maken binnen de 7 dagen. Millimeter schaal weefsel ringen bevorderlijk zijn voor mechanische testen en dienen als bouwstenen voor weefsel montage.
Elk jaar honderdduizenden patiënten ondergaan coronaire bypass operatie in de Verenigde Staten. 1 Ongeveer een derde van deze patiënten niet geschikt autologe donor schepen te wijten aan progressie van de ziekte of de vorige oogst. Het doel van vasculaire tissue engineering is het ontwikkelen van een geschikte alternatieve bron voor deze bypass grafts. Daarbij mag engineered vasculair weefsel waardevol blijken als levende vasculaire modellen om hart-en vaatziekten te bestuderen. Verschillende veelbelovende benaderingen van techniek bloedvaten zijn onderzocht, met vele recente studies gericht op de ontwikkeling en analyse van cel-gebaseerde methoden. 2-5 Hierin presenteren we een methode om snel zelf te monteren cellen in 3D weefsel ringen die kunnen worden gebruikt in vitro te vaatweefsel model.
Om dit te doen, zijn suspensies van gladde spiercellen gezaaid in de ronde bodem ringvormige agarose putten. De niet-klevende eigenschappen van de agarose toe ee-cellen om zich te vestigen, aggregaat en contract rond een paal in het midden van de put om een samenhangend weefsel ring te vormen. 6,7 Deze ringen kunnen worden gekweekt voor enkele dagen vóór de oogst voor mechanische, fysiologische, biochemische of histologische analyse. We hebben aangetoond dat deze cel afkomstige weefsel ringen opbrengst bij 100-500 kPa treksterkte 8 die de waarde gerapporteerd voor andere weefselmanipulatieproducten vasculaire bouwt gekweekt voor vergelijkbare looptijden (<30 kPa) overschrijdt. 9,10 Onze resultaten tonen aan dat robuuste cel afgeleide vaatweefsel ring generatie kan worden bereikt binnen een korte tijd, en biedt de mogelijkheid voor directe en kwantitatieve beoordeling van de bijdragen van cellen en cel afkomstige matrix (CDM) aan de vasculair weefsel structuur en functie.
Onlangs is er een toegenomen belangstelling voor cel-gebaseerde of 'steiger-less "tissue engineering methoden om enkele van de beperkingen van de steiger op basis van tissue engineering benaderingen. Gezien het feit dat uit de cel afkomstige weefsels worden gemaakt van cellen en de matrix die ze produceren, ze van nature bevatten veel hogere celdichtheden, bevatten geen exogene materialen, en kan geheel worden gemaakt van menselijke cellen en eiwitten. Vaattransplantaten gemaakt van menselijke cellen kan bereiken aanzienlijke mechanische sterkte in de afwezigheid van exogeen steigers (bv, barstdruk van 3400 mmHg vergeleken met 1600 mmHg voor de menselijke aderen) 12. Hoewel de cel-gebaseerde vaatweefsel vertonen een verbeterde cel-dichtheid en mechanische sterkte, de meeste huidige fabricage methoden (zoals 'sheet-gebaseerde engineering "3,4,12 of" bioprinting "5,13) vereisen een uitgebreide cultuur periodes (> 3 maanden) of gespecialiseerde apparatuur voor 3D weefsel bouw. De cel-afgeleide weefsel ring method hier beschreven maakt een snelle cellulaire zelf-assemblage tot robuuste 3D-weefsel constructies vormen binnen een korte tijd en zonder het gebruik van gespecialiseerde apparatuur.
Dit protocol beschrijft de procedure die wij ontwikkeld om 2 mm binnendiameter rat gladde spiercellen afgeleide weefsel ringen te creëren. In het huidige voorbeeld werden gekweekt weefsel ringen voor 7 dagen (toen gekweekt voor een extra 7 dagen voor ring-fusion en buis vorming). Echter, 2 mm rat (en menselijke) gladde spiercel ringen kunnen worden verwijderd uit de putten en zijn samenhangend genoeg zijn voor de behandeling (bijvoorbeeld overdracht naar silicone buizen) al een dag na cel zaaien. Daarnaast kunnen robuuste weefsel ringen met verschillende diameters binnenste (2, 4 en 6 mm) worden gemaakt met deze methode door simpelweg het veranderen van de functie diameter van de oorspronkelijke polycarbonaat mal. 8 Onlangs hebben we ook het polycarbonaat matrijs ontwerp aangepast om vijf 2 mogelijk mm seeding putten te worden gegoten in een enkele multi-well agarose kamer, diegebruikt minder PDMS en agarose, en past in een putje van een 6-wells plaat (gegevens niet getoond). Veranderingen in de post diameter, de breedte van het zaaien goed, de straal van de kromming van de afgeronde bodem, kan het aantal putten zaaien, of de diepte van de putten alle zaaien eenvoudig worden aangepast door het veranderen van de specificaties in het CAD-bestand voor CNC bewerking van de polycarbonaat mal. Ten slotte kan een enkele mal polycarbonaat worden gebruikt om een onbeperkt aantal templates PDMS fabriceren, en elke PDMS template kan worden gereinigd, geautoclaveerd en hergebruikt tientallen keren.
In aanvulling op het veranderen van de grootte van het weefsel ringen, hebben we ringen van veel verschillende soorten cellen, waaronder: primaire rat SMC (Cell Applications, R354-05), primaire menselijke kransslagader SMC (Lonza, CC-2583), primaire humane dermale fibroblasten 11 (gulle gift van Dr George Pins, WPI Afdeling Biomedische Technologie), ratten longfibroblasten (RFL-6, ATCC CCL-192), en de mesenchymale stamcellen (Lonza, PT-2.501). Elk van deze celtypen aggregaten en contracten rond het centrum berichten weefsel ringen vormen, hoewel de cellulaire organisatie, de ECM samenstelling en mechanische eigenschappen van de constructen verschilt voor elke cel type. Het zaaien parameters voor elk celtype dient empirisch te worden bepaald op basis van de grootte van de cellen en hun vermogen te aggregeren. Daarom, terwijl dit systeem van het creëren van cel afkomstige weefsel ringen is uiterst veelzijdig, kan het protocol nodig kleine aanpassingen voor een optimale weefsel formatie met verschillende celtypen.
Tissue ring geometrie vergemakkelijkt het laden en beoordeling van weefsel eigenschappen van het materiaal door eenassige trekproeven, zoals beschreven. Er is ook aanzienlijke precedent voor het gebruik van bloedvat ring segmenten tot vasculaire krimp en fysiologische functie te meten. Voorlopige studies wijzen erop dat uit de cel afkomstige weefsel ringen kan worden gemonteerd op een draad myograph apparaat voor het meten van farmacologische responsiviteit encontractiele kracht generatie (gegevens niet getoond). Al met al, het vermogen om snel zelf-geassembleerde cel ringen fabriceren voor histologische, mechanische, fysiologische en biochemische analyse suggereert een krachtig nieuw instrument dat nuttig kan zijn voor het modelleren van vasculair weefsel structuur en functie in gezondheid en ziekte.
The authors have nothing to disclose.
De auteurs dankbaar erkennen Neil Whitehouse (WPI, Higgins Machine Shop) voor zijn hulp bij het CNC-verspanen. Daarnaast willen we met Adriana Hera (WPI Computing and Communications Center) bedanken voor haar hulp met MATLAB programmeren, maar ook Kate Beverage en Joseph Cotnoir (WPI Academic Technology Center) voor hulp bij Camtasia. Sophie Burke en Jacleen Becker (WPI Academic Technology Center) verstrekte aanvullende video-opnamen. Dit werk werd gefinancierd door de National Institutes of Health (R15 HL097332), de UMass Medical School-WPI Pilot Research Initiative, de American Association Heart (undergraduate research fellowship aan JZH) en Worcester Polytechnic Institute (zomer Undergraduate Research Fellowship aan JZH en institutionele start-up fondsen MWR).
Name of the reagent/equipment | Company | Catalog # |
---|---|---|
Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | Sylgard 184 |
Agarose | Lonza | 50000 |
DMEM | Mediatech | 15-017-CV |
Fetal Bovine Serum (FBS) | PAA | A05-201 |
Penicillin/Streptomycin | Mediatech | 30-002-CI |
Digital imaging system | DVT Corporation | Model 630 |
Uniaxial testing machine | Instron | ElectroPuls E1000 |
Edge Detection Software | DVT Corporation | Framework 2.4.6 |