定向细胞自我组装制造，为生物力学分析与组织工程细胞衍生的组织环

1。细胞种植模具制造铣1 / 2“的聚碳酸酯中心后直径为2毫米厚片创建15日，圆底，环形井开始了。碾磨渠道6毫米深和3.75毫米宽，清洁和干燥的聚碳酸酯模删除任何铣削过程的塑料碎片。 在10:1（W / W）的基地，固化剂，脱气，以消除所有气泡，倒到聚碳酸酯模混合聚二甲基硅氧烷（PDMS）。德加再次删除任何剩余的气泡，并在60 ° C固化烤箱​​4个小时。 治愈后，小心地取出慢慢剥离聚碳酸酯的PDMS模板，用肥皂和水清洗，并高压灭菌。同时蒸压％琼脂糖（W / V）溶解在贝科的改良Eagle培养基（DMEM）的解决方案。 放置在一个水平面上的PDMS模板和填写熔融AGA第一吹打琼脂糖上升到每个中心后的模具，然后进入它周围的空间吹打。允许琼脂糖凝固（约15分钟），然后反转模具的PDMS琼脂糖释放。剪下多余的琼脂糖，各地各井和12孔板放入琼脂糖井。 2。细胞培养和环播种周围添加细胞培养基（10％FBS和1％青霉素，链霉素的DMEM）琼脂糖模具外，不包括模具的顶部。板放置在孵化器，并允许他们平衡约15分钟，当您准备的细胞。 在90％汇合，trypsinize大鼠主动脉平滑肌细胞（rSMCs）和重悬在5X10 6细胞/毫升的浓度。吸取100μL的细胞悬液到每个环形琼脂糖井，用一个细胞每孔的圆周运动。 内容“>请确保孵化器的货架上水平，然后放置在孵化器板，让他们坐了24小时不受干扰。交换的媒介，此后每隔两天吸从周围以及媒体，并重新填充每口井，直到琼脂糖以及完全淹没。 3。组织环收获和厚度测量在文化的结论，请从琼脂糖模具中心后上方滑动环。 环放置在一个小的Petri菜用磷酸盐缓冲液（PBS），中心样品，并使用数字成像系统获取图像。 使用边缘检测的图像分析程序，并测量其周长周围的4个位置（上，下，左，右）在环的厚度。计算平均厚度为每个环值（T），并使用这个值来计算的横截面积（2π（T / 2）2）。 4。机械测试的戒指拉力试验机（英斯特朗公司每股收益1000），在水平位置。附加1N ± 1mN称重传感器和自定义细线夹具（不锈钢丝弯曲创建）。 两个细线夹具安装在环形样品。延长交手，直到一个5分钟的皮重负载应用到样品。输入截面积（厚度测量计算），并记录测量长度。 前皮负载50千帕的压力，并在10毫米/分钟的速度的8倍之间循环圈。第八周期前，后拉要失败的，在10毫米/分钟。失败是指出作为一个有效的减少了40％，从一个测量到下一个。对于每个环样品，测量的极限拉伸应力（UTS）和失效应变和最大切线模量（MTM）从采集到的数据计算。 5。组织环AS组装编造组织管自定义的持有人管加工轮5厘米聚碳酸酯矩形切口（2厘米× 3厘米）的磁盘。通过这些磁盘上钻螺纹孔，让两个持有人，被拧在了一起。高压灭菌器自定义管人，然后转移到生物安全柜和一个空的培养皿。 用手术剪创建斜面边缘的角度削减1.9毫米直径的硅胶管的两端，然后高压灭菌的硅胶管。正在蒸压管，填补了与媒体的培养皿。 从琼脂糖井的戒指取出，并放置在与媒体的培养皿。地方蒸压在同一培养皿硅胶管使用前湿。 使用镊子放到中心的一环斜面结束的硅胶管，轻轻地滑入硅胶管环。所需的里数与重复农工商超市。在两个方向轻轻推他们先后沿管滑入相互接触的戒指。这种方法可用于收获后，只有一个在文化一天的戒指。 一旦环上，对齐内的聚碳酸酯持有硅胶管和螺杆两部分持有人。将在100毫米的培养皿持有人，并添加55毫升媒体。交换媒介文化的持续时间为每3天。 要删除的组织管，释放聚碳酸酯持有人的硅胶管，并使用镊子滑落到培养皿中填充用PBS的硅胶管和组织管。 6。代表性的成果： 正确执行协议时，细胞聚集形成一个内径等于相应的模具后，直径在24小时内组织环。环边缘通常是平滑的外观和（如果cultur在一个水平面上ED），是统一的，在围绕整个圆周的厚度。组织环易于处理，可从随后的机械和组织学分析井（见Gwyther等，2011 年 8）删除。环组织形态，基质成分，性能和机械性能，因种子细胞的数量和类型而定。 组织环代表从不同类型的细胞，播种条件，文化长度的结果如表1所示。两个MM的ID创建环5X10 5 rSMCs 展出 8类似的鼠细胞，人类平滑肌细胞（HSMC）环比从我们先前公布的2毫米戒指（6.6×10 5 rSMCs）创建一个较高的抗拉强度。容易聚合，形成组织环，其中包含大量的胶原蛋白后仅14天文化（数据未显示）。人类间质干细胞（HMSC）汇总，并形成凝聚力的戒指，但LAcked机械强度和发生在单轴拉伸试验的初始precycling阶段。 ñ 细胞数量厚度（mm） 文化的长度（天） 悉尼科技大学（千帕） MTM（千帕） 失效应变（毫米/毫米） RSMC环 6 660000 0.94 ± 0.12 14 97 ± 30 497 ± 91 0.50 ± 0.08 RSMC环 4 500000 0.53 ± 0.02 7 113 ± 8 189 ± 15 0.88 ± 0.05 HSMC环 3 750000 0.51 ± 0.05 14 160 ± 30 270 ± 20 0.92 ± 0.08 HMSC环 3 750000 0.40 ± 0.07 14 N / A N / A N / A 表1。表显示的文化参数和从不同的细胞类型，播种浓度，和文化的持续时间产生的2毫米环的机械性能。 图1：（一）组织环生成过程的示意图。 （二）自定义聚碳酸酯模碾磨环形井。中央邮政局直径为2毫米。 （三）PDMS模板后，这是从聚碳酸酯模去皮。 （四）培养琼脂糖模具聚合组织环与一个2毫米后。 （e）两毫米直径的PBS组织环。比例尺= 6毫米（B，C）和2毫米（D，E）。 图2代表积应力-应变曲线机生产线。CED从单轴拉伸试验。