توضح هذه المقالة طريقة لخلق تنوعا حلقات نسيج الخلايا المشتقة من قبل الخلوية التجمع المصير. خلايا العضلات الملساء في البطولة على شكل حلقة الآبار التجميعية agarose وعقد لتشكيل قوة ثلاثية الأبعاد (3D) الأنسجة في غضون 7 أيام. حلقات الأنسجة ملليمتر النطاق تؤدي إلى اختبار الميكانيكية وتكون بمثابة اللبنات لتجميع الأنسجة.
كل عام ، مئات الآلاف من المرضى الخضوع لعملية جراحية في الشريان التاجي في الولايات المتحدة. 1 حوالي ثلث هؤلاء المرضى لم يكن لديك مناسبة السفن المانحة ذاتي بسبب تطور المرض أو الحصاد السابق. ان الهدف من هندسة الأنسجة الوعائية هي تطوير مصدر بديل مناسب لهذه الطعوم الالتفافية. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن هندستها الأنسجة الوعائية تثبت قيمتها بوصفها كائنات حية نماذج الأوعية الدموية لدراسة أمراض القلب والأوعية الدموية. تم استكشاف العديد من النهج الواعدة في الأوعية الدموية والهندسة ، مع العديد من الدراسات الحديثة التي تركز على التنمية وتحليل الخلية المستندة إلى الأساليب. 2-5 وهنا ، فإننا نقدم وسيلة لتجميع الخلايا ذاتية بسرعة الى حلقات النسيج 3D التي يمكن استخدامها في المختبر لنموذج الأنسجة الوعائية.
للقيام بذلك ، يتم تعليق المصنف خلايا العضلات الملساء في قاع بئر مستديرة agarose الحلقي. خصائص غير لاصقة للسماح عشر agaroseخلايا ه لتسوية والركام والعقد حول آخر في مركز جيد لتشكيل عصابة نسيج متماسك. 6،7 هذه الحلقات يمكن أن يكون المثقف لعدة أيام قبل الحصاد لالميكانيكية والتحليل ، والفسيولوجية البيوكيميائية ، أو النسيجية. لقد أثبتنا أن هذه الحلقات نسيج الخلايا المشتقة من العائد على 100-500 قوة الشد كيلوباسكال النهائي (8) الذي تجاوز قيمة المبلغ عنها ليبني أنسجة الأوعية الدموية الأخرى هندسيا مثقف لفترات مماثلة (<30 كيلو باسكال). 9،10 نتائجنا تظهر ان الخلايا القوية لا يمكن أن يتحقق المستمدة من الأنسجة الوعائية حلقة جيل في غضون فترة زمنية قصيرة ، ويتيح الفرصة لتقييم مباشر والكمي للمساهمات من الخلايا والخلايا المشتقة من مصفوفة (CDM) لبنية الأنسجة الوعائية ووظيفتها.
مؤخرا ، كان هناك اهتمام متزايد في بناء الخلية أو "سقالة أقل" أساليب هندسة الأنسجة لمعالجة بعض أوجه القصور في النهج القائمة على سقالة هندسة الأنسجة. بالنظر إلى أن يتم إنشاء خلية الأنسجة المشتقة من الخلايا والمصفوفة التي تنتجها ، أنها تحتوي بطبيعتها كثافة الخلية أعلى من ذلك بكثير ، لا تحتوي على مواد خارجية ، ويمكن أن يكون مصنوع بالكامل من خلايا الإنسان والبروتينات. يمكن ترقيع الأوعية المصنوعة من خلايا الإنسان تحقيق القوة الميكانيكية كبيرة في غياب السقالات الخارجية (على سبيل المثال ، والضغوط تنفجر 3400 مم زئبق مقارنة مع 1600 مم زئبقي للالصافن عروق الإنسان) 12. على الرغم من خلية مقرها الأنسجة الوعائية المعرض تحسين كثافة الخلايا والقوة الميكانيكية ، وطرق تصنيع معظم الحالية (مثل "الهندسة ورقة تستند" 3،4،12 أو "bioprinting" 5،13) تتطلب ثقافة واسعة فترات (> 3 أشهر) أو المعدات المتخصصة للبناء الأنسجة 3D. الحلقة نسيج الخلايا المشتقة من ميثوصف التطوير التنظيمي هنا تمكن السريع الخلوية التجميع الذاتي لتشكيل نسيج متين يبني 3D في غضون فترة قصيرة من الزمن ، ودون استخدام معدات متخصصة.
هذا البروتوكول تفاصيل الإجراء قمنا بتطويرها لإنشاء 2 ملم الجرذان قطرها الداخلي السلس الخلايا المشتقة من حلقات العضلات الأنسجة. في المثال الحالي ، ومثقف حلقات النسيج لمدة 7 أيام (لتربيتها ثم 7 أيام إضافية للاندماج وتكوين عصابة أنبوب). ومع ذلك ، 2 ملم الجرذان (والبشر) يمكن إزالة الخلايا العضلية سلسة حلقات من الآبار ومتماسكة بما فيه الكفاية للتعامل مع (على سبيل المثال ، نقل على أنابيب السيليكون) في أقرب وقت بعد يوم واحد زرع الخلايا. بالإضافة ، يمكن إنشاء شبكات قوية مع الأنسجة الداخلية بأقطار مختلفة (2 ، 4 ، و 6 ملم) مع هذا الأسلوب ببساطة عن طريق تغيير قطر آخر من العفن البولي الأصلي. 8 ونحن أيضا في الآونة الأخيرة تعديل تصميم قوالب البولي لتمكين five 2 آبار بذر ملم من المقرر ان يلقي في غرفة واحدة متعددة agarose جيدا ، والتيويستخدم أقل PDMS agarose ، ويناسب أيضا في واحدة من لوحة 6 – جيدا (لا تظهر البيانات). تغييرات في قطر آخر ، وعرض البذر أيضا ، في دائرة نصف قطرها من انحناء أسفل مدورة ، ويمكن كل عدد من الآبار البذر ، أو عمق الآبار بذر يمكن تعديل ببساطة عن طريق تغيير المواصفات في الملف CAD لCNC بالقطع من العفن البولي. أخيرا ، يمكن استخدام قالب واحد لافتعال البولي عدد غير محدود من القوالب PDMS ، ويمكن تنظيفها كل قالب PDMS ، تعقيمها وإعادة استخدامها عشرات المرات.
بالإضافة إلى تغيير حجم الحلقات الأنسجة ، وحققنا الكثير من الخواتم من أنواع مختلفة من الخلايا ، بما في ذلك : SMCs الفئران الأساسية (تطبيقات الخليوي ، R354 – 05) ، المرحلة الابتدائية الإنسان SMCs الشريان التاجي (Lonza ، CC – 2583) ، الإنسان الأساسية الجلد الليفية 11 (هدية سخية من الدبابيس الدكتور جورج WPI قسم الهندسة الطبية الحيوية) ، الرئة الليفية الفئران (إعادة الروابط العائلية – 6 ، ATCC CCL – 192) ، والخلايا الجذعية الوسيطة (Lonza ، PT-2501). كل من هذه الخلية أنواع الركام والعقود حول الوظائف مركز على شكل حلقات الأنسجة ، على الرغم من تنظيم الخلوية ، وتكوين ECM ، والخصائص الميكانيكية للبنيات تختلف عن كل نوع من الخلايا. يجب أن تكون المعلمات بذر لكل نوع من الخلايا تحدد تجريبيا على أساس حجم الخلايا وقدرتها على تجميع. لذا ، في حين أن هذا النظام خلق حلقات نسيج الخلايا المشتقة مرنة للغاية ، قد تحتاج بروتوكول تعديلات طفيفة لتكوين الأنسجة الأمثل مع أنواع مختلفة من الخلايا.
هندسة النسيج الدائري يسهل التحميل سهلة وتقييم خواص المواد الأنسجة عن طريق اختبار الشد أحادي المحور ، كما هو موضح. هناك أيضا سابقة كبيرة لاستخدام شرائح الدم حلقة السفينة لقياس تقلص الأوعية الدموية وظيفة فسيولوجية. الدراسات الأولية تشير إلى أن يمكن تركيبه حلقات نسيج الخلايا المشتقة على سلك جهاز myograph لقياس الاستجابة الدوائية ومقلص قوة جيل (لا تظهر البيانات). تماما ، والقدرة على افتعال بسرعة حلقات خلية الذاتي تجميع للتحليل النسيجي والميكانيكية والفسيولوجية والبيوكيميائية ويشير إلى وجود أداة قوية جديدة قد تكون مفيدة للبنية الأنسجة الوعائية النمذجة وظيفة في مجال الصحة والمرض.
The authors have nothing to disclose.
الكتاب الامتنان نيل ايتهاوس (WPI وهيغنز صناعة الآلات) لمساعدته مع التصنيع باستخدام الحاسب الآلي. بالإضافة إلى ذلك ، نود أن نشكر أدريانا هيرا (WPI الحاسبات ومركز للاتصالات) ليساعدها مع برمجة MATLAB ، وكذلك المشروبات كيت وجوزيف كوتنوير (WPI الأكاديمية مركز تقنية) للحصول على المساعدة مع كمتسا. قدمت صوفي وبورك Jacleen بيكر (WPI الأكاديمية مركز تقنية) تكميلية لقطات الفيديو. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (R15 HL097332) ، وبحوث الطبية UMass المدرسة التجريبية WPI المبادرة ، وجمعية القلب الأميركية (الزمالة البحثية الجامعية إلى JZH) ، ورسستر معهد البوليتكنيك (زمالة البحوث الجامعية الصيفية لJZH والمؤسسية بدء الأموال لMWR).
Name of the reagent/equipment | Company | Catalog # |
---|---|---|
Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | Sylgard 184 |
Agarose | Lonza | 50000 |
DMEM | Mediatech | 15-017-CV |
Fetal Bovine Serum (FBS) | PAA | A05-201 |
Penicillin/Streptomycin | Mediatech | 30-002-CI |
Digital imaging system | DVT Corporation | Model 630 |
Uniaxial testing machine | Instron | ElectroPuls E1000 |
Edge Detection Software | DVT Corporation | Framework 2.4.6 |