Optische kaart brengen van actiepotentialen en Calcium Transiënten in de muis Hart

1. Geavanceerde bereiding van de stam oplossingen Bereid twee voorraad oplossingen van de oplossing Tyrode's (16x), van te voren in gedeïoniseerd water en ze op te slaan 4 ° C: Stock I (119,872 g / L NaCl, 3,056 g / L CaCl 2 (2H 2 O), 5,6 g / L KCl, 2,6274 g / L NaH 2 PO 4, 3,408 g / L MgCl 2 (6H 2 O), (Fisher wetenschappelijke, Fair Lawn, NJ)); Stock II (26,88 g / L NaHCO3, (Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ)). Bereid voorraad oplossingen van fluorescerende kleurstoffen. Om te voorkomen dat herhaaldelijk bevriezen en ontdooien, slaan we 30 ul fracties van beide kleurstoffen bij -20 ° C, wat voldoende is voor een experiment: Voltage-gevoelige kleurstof RH237 (Invitrogen, Carlsbad, CA) stock-oplossing, 1,25 mg / ml oplossing in dimethylsulfoxide (DMSO, Sigma, St. Louis, MO); Calcium indicator Rhod-2AM (Invitrogen, Carlsbad, CA) stock-oplossing, 1 mg / ml oplossing in DMSO. Bereid excitatie-contractie ontkoppelrail blebbistatin stockoplossing (Tocris Bioscience, St. Louis, MO, 2 mg / ml oplossing in DMSO) vooraf en opslaan van de opgeloste blebbistatin bij 4 ° C. 2. Bereid perfusie-oplossingen en experimentele opstelling 7 Vers voor te bereiden 2L Tyrode de oplossing (128.2mM NaCl, 1,3 mm CaCl 2 (2H 2 O), 4.7mM KCl, MgCl 1.05mM 2 (6H 2 O), 1.19mM NaH 2 PO 4, 20mm NaHCO 3, 11,1 mm D-Glucose in gedeïoniseerd water, pH = 7,35 ± 0,05). Als voorraad oplossing wordt gebruikt om 2L oplossing Tyrode's (voldoende voor een experiment) te nemen 1750 ml gedeïoniseerd water en meng in 125 ml op voorraad I, 125 ml van Stock II, en 4g van glucose. Zet de twee pompen van de perfusie-systemen. Stel de peristaltische pomp (Peri-Star, WPI, Sarasota, USA) die wordt gebruikt voor retrograde perfusie tot 40 ml / min. Stel de andere peristaltische pomp (Cole-Parmer Masterflex Peristalic Pomp L / S, Cole-Parmer Instrument Company, Vernon Hills, Illinois) die wordt gebruikt voor superfusie en om het perfusaat terug te keren naar de holding reservoir tot 80 ml / min. Was de perfusie-systeem met 70% ethanol gedurende 30 minuten en dan met 2L gedeïoniseerd water. Zodra alle gedemineraliseerd water wordt afgevoerd uit de kamer, circuleren van de Tyrode de oplossing en het door een 5-um filter (Millipore, Billerica, MA, USA) passeren. Warm het perfusaat tot +37 ° C met een watermantel en circulatiepomp (ThermoNESLAB EX7, Newtown, USA) en zuurstof het perfusaat door borrelen O 2 / CO 2 (95% / 5%) gas in de oplossing. Monitor de pH van de oplossing met een pH-meter (Oakton Instruments, Vernon Hills, IL) en pas de snelheid van O 2 / CO 2 borrelen om de pH te houden op 7,35 ± 0,05. Blijven volgen pH en temperatuur tijdens het experiment. De dubbele optische kaart brengen apparaat bestaat uit twee Micam Ultima-L CMOS-camera's (SciMedia, Costa Mesa, CA), die een hoge ruimtelijke (100×100 pixels, 230 ± 20 micrometer per pixel) en temporele (1,000-3,000 frames / sec) resolutie. Fix een band-pass filter (590 ± 15 nm, Thorlabs, Newton, NJ) in de voorkant van de aangewezen calcium beeldcamera, terwijl, een lange-pass filter (> 700 nm, Thorlabs, Newton, NJ) moet worden geplaatst in voorkant van de aangewezen spanning beeldvorming camera. De camera's zijn loodrecht aan elkaar opgesteld door een houder, die een dichroïsche spiegel (635 nm cutoff, Omega Optical, Brattleboro, VT) bevat. Direct onder de dubbele camera houder is er een lens (Nikon NIKKOR 55 mm 1:1.4 235.052), die de emissie licht richt zich vanuit het hart op de dichroïsche spiegel. De werkafstand is ongeveer 3cm. De excitatie licht wordt gegenereerd door een halogeenlamp (Newport Oriel Instruments, Stratford, CT, SciMedia, Costa Mesa, CA) en wordt doorgegeven door middel van een warmte-filter, sluitertijd, en de band-pass filter (520 ± 45 nm). Een flexibele lichtgeleider stuurt de band-pass gefilterd licht op de voorbereiding, en een sluitertijd wordt gebruikt om ervoor te zorgen dat de voorbereiding wordt blootgesteld aan het licht alleen tijdens de beeldacquisitie om te voorkomen dat fotobleken van de kleurstoffen. Bereid Ag / AgCl 2 elektroden voor stimulatie en detectie van te voren en installeer ze in de kamer voorafgaand aan het plaatsen het hart. Zorg ervoor dat de versterkers en filters worden aangepast aan geschikte niveaus. 3. Oogst de muis hart, canule, en stel Langendorff perfusie Verdoven van de muis met ketamine / xylazine (ketamin, 80mg/kg lichaamsgewicht, xylazine, 10 mg / kg lichaamsgewicht) en heparine (100 eenheden) door intraperitoneale injectie. Verzekeren passend niveau van de anesthesie door het gebrek aan pijn reflex. Na een tussentijdse borstbeen incisie, snel verwijdert u het hart en in zuurstofrijk was (95% O 2, 5% CO 2), een constante temperatuur (37 ± 1 ° C) Tyrode's oplossing. Met behulp van een dissectiemicroscoop, Snel identificeren van de aorta en maak een schone dwars door de stijgende aorta onder het rechter a. subclavia. Een korte deel van de aorta wordt vervolgens gekoppeld aan een op maat gemaakte 21-gauge canule met een uitlopende tip. 4-0 zwart gevlochten zijden hechtmateriaal (chirurgische Specialties Corporation, Reading, PA) wordt gebruikt om het hart vast op de canule. Na cannulatie, is het hart retrogradely perfusie en superfused met de oplossing Tyrode's. De retrograde perfusie snelheid wordt aangepast in het bereik van 2-5 ml / min aan de aorta druk tussen de 60 en 80 mmHg (Pressure transducer, World precisie-instrumenten Inc (WPI), Sarasota, USA te houden; Bridge versterker TBM4M, WPI, Sarasota, USA). Nadat het hart is gecanuleerde, zijn de longen, thymus, en vetweefsel vervolgens ontleed en verwijderd. De geïsoleerde hart is gespeld (Fine Science Tools) aan de top naar de bodem van de perfusie kamer (Sylgard gecoat) te streamen-geïnduceerde beweging te voorkomen. De rechter-en linker atrium aanhangsels zijn ook uitgerekt en vastgezet (Fine Science Tools, Inc, Foster City, CA) op de bodem van de kamer, die maximale oppervlakte zorgt voor optische metingen van de atria. Heel belangrijk! Een klein siliconen buisje wordt ingebracht in de linker ventrikel via de longaders en gefixeerd door zijden hechtdraad naar het nabijgelegen bindweefsel. Dit voorkomt oplossing congestie en verzuring van het perfusaat gevangen in de linker ventrikel, wat vooral belangrijk is na de onderdrukking van ventriculaire contracties met een excitatie-contractie ontkoppelrail (zie deel 4 stap 19). Een op maat gemaakte elektrode wordt geplaatst op het oppervlak van het hart naar de pacing prikkels, die wordt gegenereerd door Master-8 (AMP Instruments Ltd, Jeruzalem, Israël) of PowerLab 26T (AD Instruments, Sydney, Australië) gedrag. Een klein afdekglas is gefixeerd op het oppervlak van de oplossing over het hart om bewegingsartefacten te verminderen van de trillende oplossing. Focus van de excitatie licht op het hart. Daarnaast is de afstand tussen de dubbele camera apparatuur en het hart, zodat een maximale resolutie zal worden verkregen. Schakel alle lichten in de kamer en beginnen elektrische opnamen met behulp van PowerLab 26T. 4. Load voltage en calcium gevoelige kleurstoffen en excitatie-contractie ontkoppelrail Warm-up 0,6 ml blebbistatin. Mix 0,5 ml van de blebbistatin met het perfusaat op het bedrijf reservoir. Verdun de resterende 0,1 ml blebbistatin in 1 ml van de oplossing Tyrode en langzaam te injecteren (over een periode van 20 minuten) via een drug-poort in de buurt van de canule. Let op als blebbistatin geleidelijk vermindert de bewegingsartefacten. Verdun 30 pi van de spanning gevoelige kleurstof RH237 voorraad oplossing in een 1 ml Tyrode en langzaam over 5-7 minuten te injecteren in dezelfde injectie poort als blebbistatin. 30 pi calcium indicator Rhod-2 AM is 1:1 gemengd met Pluronic F127 (Invitrogen, Carlsbad, CA, 20% oplossing in DMSO) en vervolgens verdund in een oplossing mL Tyrode en langzaam toegepast over 5-10 min via dezelfde injectiepoort . Wacht op 5-10 minuten voor blebbistatin en kleurstoffen aan de celmembraan en cytosol te bereiken. Ga verder met het protocol wanneer er beweging volledig wordt onderdrukt. Permanent toezicht op ECG-opnamen over het gehele procedure om de normale elektrische functie van het hart verzekeren. Beginnen fluorescentiesignaal opnamen met de SciMedia aangepaste software (SciMedia, Costa Mesa, CA). 5. Representatieve resultaten: Figuur 1. Experimentele opstelling voor de perfusie, de elektrische en optische opnames in kaart brengen. EM = emissie; Lp = longpass Figuur 2. Experimentele voorbereiding en het signaal voorbeelden opgenomen tijdens ventriculaire pacing. Links: ECG-signalen worden verzameld van Ag / AgCl 2 disk elektroden (Top) en een voorbeeld van S1S1 stimulatie protocol wordt getoond (Bottom). Center: Langendorff muis hart voorbereiding. Rechts: Representatieve optische actiepotentialen en calcium voorbijgaande signalen van atria (Top) en de ventrikels (Onder) worden getoond. De gele pijl (Top) wijst op het fluorescerende signaal verstrooiing afkomstig uit de hartkamers, die wordt gezien in de atriale opnames. LV = linker ventrikel; RV = Rechts ventrikel; LA = links atrium; RA = rechts atrium Figuur 3. Vertegenwoordiger optische opnames van V m en kat uit de ventrikels van een wild-type muis het hart. A. De experimentele voorbereiding met een reeks van gelijkmatig verdeelde locaties gemarkeerd door zwarte stippen waarvan de optische-opnames zijn te zien in (C). B. Voorbeeld tracing van V m en CaT vanaf een centrale locatie op de matrix (zie kader in (C)). C. V m (blauw) en CAT (rood) uit de reeks van gelijkmatig verdeelde locaties. Signalen waren weggegooid 3×3. Figuur 4. Activering kaart en geleiding. A. Een voorbeeld activering kaart uit een wild-type muis hart met dwarse (T) en longitudinaal (L) richtingen aangegeven met witte pijlen. B. V m signalen (Top) en dV / dt (Onder) die overeenkomen met de drie punten te zien in A (T1, T2, T3, L1, L2, L3). Figuur 5. Action potentieel en calcium voorbijgaande duur analyse. A. Actie mogelijke duur bij 80% repolarisatie (APD80) en calcium voorbijgaande duur op 80% ontspanning (CaD80) kaarten zijn vanaf een hart onder controle condities (links) en na 30 nM isoproterenol applicatie (rechts). De geel / groene kleur in de ventrikels (rechts) geeft aan isoproterenol verkort APD80 en CaD80. B. Voorbeeld traces van APD80 en CaD80 van de wild-type muis ventrikels (Top) en atria (onder).