Um método de genotipagem baseados em PCR para distinguir entre variedades do tipo selvagem e Ornamental de Imperata cylindrica</em

1. Colheita e Preservação Este método foi desenvolvido e testado usando frescos, congelados, e tecidos de folhas secas recentemente. Identificar cogongrass e / ou JBG tecidos com a ajuda de um taxonomista que se especializa na identificação das espécies de grama. Com os seus brilhantes folhas vermelhas, JBG ornamental é fácil de distinguir visualmente a partir de tipo selvagem e cogongrass JBG reverter, no entanto, cogongrass e JBG reverter são quase indistinguíveis um do outro. Cogongrass eo fenótipo JBG revertido tem folhas verdes, longos, rizomas consideravelmente maiores e mais longos, e mais área foliar do que JBG 12 (Figura 1). Tecido foliar fresco fornece DNA a qualidade mais abundante e mais alto e podem ser coletadas a partir do campo ou estufa cresceu I. plantas cylindrica. Se o tecido fresco é para ser usado, extrair DNA no prazo de 3 horas após a recolha para ajudar a prevenir a degradação. Caso contrário, preparar tecido para o armazenamento, keeping o tecido fresco e fora da luz solar direta. Para armazenar tecidos de extracção de ADN numa data posterior, o método mais óptima é a congelar e armazenar o tecido à temperatura de -80 ° C imediatamente. Não permitir que o tecido congelado para descongelar antes da extracção do DNA. Transferir o tecido congelado em azoto líquido antes para os passos de moagem de extracção de ADN para prevenir o descongelamento. Se uma temperatura de -80 ° C congelador não estiver disponível, o tecido seco imediatamente. Para armazenamento a seco, colocar o tecido em um envelope de papel e armazenar o envelope em gel de sílica desidratada ou outros dessecantes activas à temperatura ambiente. Uma pequena quantidade de sílica indicador misturado com não-indicando sílica irá assegurar que a sílica é totalmente desidratada e adequado para secagem de tecidos vegetais. Use pelo menos 10 vezes em gel de sílica mais do que o tecido de folha fresca, em peso. Tecido de planta deve secar no prazo de 24 horas. A qualidade ea quantidade de DNA é reduzido por meio de armazenamento seco ao longo do tempo (como no caso de espécime herbários). 2. Extração de DNA Para extrair DNA a partir de tecido de planta, siga o DNeasy Planta Mini Kit (Qiagen, Valência, CA; Cat # 69104 ou 69106) as instruções do fabricante, com uma pequena modificação. Em vez de utilizar o tecido mg sugerido inferior a 100 fresco ou inferior a 20 mg de tecido seco para cada coluna, moer maior do que 100 mg, e, em seguida, transferir 100 mg a partir de tecido fresco ou congelado (ou> 20 mg de tecido seco) para tubos apropriados para a extração. DNA nuclear e plastidial é extraído em simultâneo. Antes de iniciar estes procedimentos, verificar que o etanol foi adicionado em buffers AP3 / E e AW. Moer> 100 mg de tecido foliar fresco ou congelado (ou> 20 mg de tecido foliar seco) a um pó fino usando três rondas de azoto líquido com trituração num almofariz e pilão refrigeradas. Perturbação insuficiente do material de partida ou lise insuficiente pode também resultará em rendimentos mais baixos de DNA. Cuidadosamente moer o tissue e não sobrecarregue as colunas com o tecido em excesso. Transferir 100 mg de pó a partir de tecido congelado fresco ou congelado (ou 20 mg de pó a partir de tecido seco) para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml contendo 400 ul de tampão de AP1 e 4 uL de RNase A. Cada tubo pode ser colocado em uma cremalheira pequena num equilibrar para monitorar o peso correcto de tecido por tubo. Amostra de vórtice ou de vibração (s) para misturar e incubar durante 10 min a 65 ° C, invertendo o tubo (s) de 2-3 vezes durante a incubação. Adicionar 130 uL de Tampão de AP2 a cada amostra. Misturar invertendo o tubo (s) várias vezes, e incubar durante 5 min em gelo. Pipetar lisado cada um em separado coluna de spin QIAshredder Mini, e colocar cada coluna em um tubo de recolha de 2 ml (fornecido com o kit). Coluna de centrifugação (s) durante 2 min a 20.000 xg (14.000 rpm ~), e transferir cada fluxo através fracção para um novo tubo (não fornecido com o kit), sem perturbar qualquer sedimento formado. Adicionar 1,5 volumes de Tampão AP3 /E, misturar e por pipetagem. Transferir 650 uL de mistura em uma coluna de spin DNeasy Mini em um tubo de recolha de 2 ml. Coluna de centrifugação (s) durante 1 min a 6000 xg (8000 rpm ~), e descartar o fluxo através. Repetir este passo com a mistura remanescente para cada amostra. Coloque a coluna de spin (s) para um novo tubo de recolha de 2 ml (s), e adicionar 500 uL de tampão de AW para o início de cada coluna. Coluna de centrifugação (s) durante 1 min a 6000 xg (8000 rpm ~), e descartar flow-through. Adicionar outra uL 500 de AW tampão para o início de cada coluna. Centrifugar durante 2 min a 20.000 xg (~ 14.000 rpm). Este passo irá secar a coluna, removendo assim qualquer etanol residual contido nos buffers que podem inibir a PCR. Transfira cada coluna de rotação para um tubo de 1,5 ml nova amostra de microcentrífuga. Adicionar 100 uL AE tampão para o início de cada coluna para a eluição, e incubar em coluna (s) durante 5 min à temperatura ambiente. Coluna de centrifugação (s) durante 1 min a 6000 xg (~ de 8.000 rpm) para recolher o ADN. Repita estes passos de eluição uma hora, eluindo o DNA para o mesmo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml para se obter 200 uL de amostra. As amostras de DNA armazenar a -20 ° C até à utilização. Concentrações de ADN dependem do tipo de tecido e as condições de armazenagem. Rendimentos óptimos são obtidos quando eluindo DNA com um total de 200 uL de tampão de AE, no entanto, as concentrações podem ser aumentadas se volumes de eluição são reduzidos a tão pouco quanto 50 uL. 3. Verificação da qualidade e quantidade de DNA Testar a qualidade ea quantidade de DNA extraído antes da PCR configuração usando um espectrofotómetro ou fluorómetro e electroforese em gel. Isso ajudará a garantir o sucesso das etapas subseqüentes. Utilizando um espectrofotómetro, a qualidade do DNA de teste e quantidade. Rendimento de ADN boas deve estar entre 50 e 150 ng / uL com 260/280 e 230/280 rácios cerca de 2,0. Como um exemplo, a Figura 2 mostra os resultados de boa qualidade usando o espectrofotómetro NanoDrop (ThermoScientific, Wilmington, DE). Conduzir electroforese utilizando um padrão de 1% de gel de agarose. Verificar a presença de bandas relativamente grande (> 10 Kb), sem a estrias pouco de contaminação RNA (Figura 3). Se a concentração de ADN é elevada, amostras de DNA diluir até 70 ng / uL de passos subsequentes. 4. Primers de PCR Os iniciadores de PCR utilizados neste protocolo são baseados em diferenças de sequência entre a região espaçadora plastidial trnL F-de genótipos cogongrass e JBG. Estas diferenças surgem na forma de SNPs (polimorfismos de um único nucleótido) e indels (inserções e deleções) que permitiram o desenvolvimento de uma variedade primers específicos, localizando os iniciadores nos locais de sequências únicas (Figura 4). A qualidade dos iniciadores podem ter um impacto significativo sobre os resultados da PCR. Iniciadores da ordem de uma companhia respeitável. Nós ordenamos nossos primers de Oblique Bio, Inc. (:/ / Www.obliquebio.com/web/ "target =" _blank "> http://www.obliquebio.com/web/, Huntsville, AL), solicitando apenas procedimentos padrão de dessalinização. trnL-F iniciadores de controlo positivo: Este conjunto de iniciadores amplifica a região espaçadora plastidial trnL F-de taxa mais grama 11-13 e serve como um bom controle positivo (resultando em uma banda pb 890). Nome Seqüência trnF (GAA)-F 5'-ATTTGAACTGGTGACACGAG-3 ' trnL (5 'do exão)-C 5'-CGAAATCGGTAGACGCTACG-3 ' Iniciadores de tipo selvagem cogongrass: Este conjunto iniciador é específico para cogongrass e não amplificar a região F-trnL de JBG genótipos. Os resultados conjuntos em uma banda que é 595 bp. Nome Sequência trnLF-C-F1 5'-TCCACTTTTTTGAAAAAACAAGTGCAA-3 ' trnLF-C-R1 5'-GCCGATACTCTAATAAATAAAAAAAAAAAAGAAAT-3 ' JBG e JBG Reverter iniciadores: Este conjunto de iniciadores é específico para JBG genótipo e não amplificar a região F-trnL de cogongrass. Os resultados conjuntos em uma banda que é 594 bp. Nome Seqüência trnLF-R-F2 5'-CCAAATCCACTTTTTTGAAAAAACAAGTGGTT-3 ' trnLF-R-R2 5'-CGAGATTCCTTGCCGATACTCTAATAAAA-3 ' Ressuspender cada iniciador, em volume suficiente de nuclease livre de ddH2O para se obter um stock de 100 mM de soluções que podem ser armazenados a -20 ° C, a longo prazo. Diluir cada ação primário a 12 mm antes das etapas de instalação da PCR. 5. PCR Setup DNA extracções são amplificados utilizando cada um dos conjuntos de iniciadores acima em reacções de PCR. Incluir um controlo positivo para assegurar que todos os reagentes de PCR estão a funcionar bem e pode gerar uma banda. Incluir um controlo negativo para assegurar que nenhum dos reagentes estão contaminados com DNA indesejado. O controlo negativo não contém nenhum-molde e deve resultar em nenhuma produção banda. Preparar todas as reacções em tubos de paredes finas de PCR para permitir uma melhor transferência de calor entre o bloco de termociclador ea amostra. É recomendável usar comercialmente disponíveis pontas de aerossol livres de pipeta para ajudar a evitar a contaminação. Para cada amostra de ADN isolado, configurar 50 uL reacções de PCR utilizando cada um dos conjuntos de iniciadores acima em 0,2 ml tubos de paredes finas de PCR adicionando os seguintes reagentes em ICE na ordem listada abaixo. Se as amostras múltiplas estão a ser preparadas, fazer um cocktail contendo todos os reagentes com a excepçãodo molde de ADN para estabelecer as condições uniformes entre todas as reacções. Reagente PCR Volume Usado Concetration final Livre de nuclease ddH2O 40,5 ul Vantagem 2 10X PCR Buffer (Clonetech, CA) 5,0 ul 10% (v / v) Vantagem UltraPure PCR dNTP Mix (10 mm cada, Clonetech, CA) 1,0 ul 0,2 mM Primer 1 (12μM em ddH2O) 1,0 ul 0,24 mM Primer 2 (12μM em ddH2O) 1,0 ul 0,24 mM Vantagem Mix Polimerase 2 (Clonetech, CA) 0,5 ul 1% (v / v) Extração de DNA(70 ng / reação; ajustar DDH O 2 º volume, conforme necessário) 1,0 ul 1,4 ng / uL Total: 50,0 uL Para garantir que todos os reagentes da PCR estão funcionando bem, configurar o controle positivo utilizando os primers de controlo positivo. Este conjunto de primers funciona igualmente bem para cogongrass, JBG, JBG reverter e outras gramíneas e resultará em uma banda que é 890 bp. Configurar o controlo negativo utilizando o iniciador mesmo controle definido como o controlo positivo, usando ddH2O em vez de a extracção do DNA. Se todos os reagentes estão livres de DNA contamina, esta reacção irá resultar em nenhuma banda. Se a concentração de DNA é baixa, mais DNA pode ser adicionado a cada reacção, ajustando a quantidade de Nuclease livre de ddH2O utilizado para levar o volume total de reacção de 50 uL. Não utilizar mais do que 5 ul de DNA (10% do o volume total) por reaction, impurezas como possíveis contidas nas amostras de DNA pode inibir reacções de PCR. 6. PCR bicicleta Efectuar amplificações por PCR em um termociclador equipado com uma tampa aquecida usando os parâmetros de ciclagem seguintes PCR. Usamos o Mastercycle pro S termociclador (Eppendorf, Hauppauge, NY) configurado para operar com as condições de rampa padrão de temperatura. Qualquer termociclador qualidade deve ter um bom desempenho. Ciclo Desnaturação Recozimento Polimerização 1 2 min a 95 ° C 2 30 seg a 95 ° C 30 seg a 61 ° C 90 seg a 68 ° C 35 ciclos 3 5 min a 68 ° C Mantenha a 4 ° C até que a amostra é removida </td> Optimizar as condições para o PCR (incluindo a temperatura de recozimento iniciador, os tempos de extensão, eo número de ciclos), conforme necessário, dependendo da qualidade do ADN, os iniciadores, Taq polimerase ou tipo de termociclador utilizado. Sugerimos utilizando um termociclador de gradiente capaz quando a determinação do óptimo recozimento temperaturas. Se o termociclador a ser utilizado não tem uma tampa aquecida, adicionar 1 gota de óleo mineral para o início de cada amostra para evitar a evaporação durante o ciclismo PCR. 7. Electroforese em gel de produtos de PCR Para visualizar os resultados da análise, os produtos de PCR separadas sobre um gel de agarose 1%, usando electroforese padrão. Combinar 2 ul de um tampão padrão de ADN de carga (tipicamente uma solução 5x ou 6x) com 5 uL de cada produto de PCR amplificado. Carregar amostras sobre um gel de agarose a 1% contendo EtBr (brometo de etídio para a coloração do ADN) e feita comither TAE ou SB (borato de sódio) sistemas tampão 16. Usamos 1 ul de uma solução estoque de 10 mg / ml EtBr por 100 ml de agarose a 1% (0,1 ug / ml). Executar amostras em ~ 120V até que a frente de corante atinge ¾ do comprimento total do gel. Sob a luz UV (por exemplo, uma onda curta caixa de luz UV), inspecionar as bandas resultantes para ver se um fragmento apropriado foi amplificado. Documentar o gel e as bandas resultantes usando um sistema de foto-documentação disponível ou câmera. 8. Os resultados representativos Após a visualização dos produtos de PCR, cogongrass tem um padrão único de bandas comparada com a de JBG ou revertido JBG (Figura 5). Para cada amostra de DNA, o trnL-F conjunto de iniciadores de controlo positivo deve resultar numa banda de alta intensidade em ~ 890 pb. Isso verifica se todos os reagentes da PCR estão funcionando bem. Do mesmo modo, o controlo negativo (nenhum modelo) reacção não deve conter bandas para qualquer s iniciadoret utilizado. Isto verifica que nenhum dos reagentes foram contaminadas. Se a amostra de DNA é derivado do tipo selvagem cogongrass, uma reacção de PCR usando o conjunto de iniciadores cogongrass específico irá resultar em uma única banda a ~ 595 pb, enquanto os iniciadores específicos do JBG irá resultar em nenhuma banda. Da mesma forma, se a amostra de DNA é derivado do JBG ou revertido JBG, uma reacção de PCR usando o conjunto de iniciadores JBG específico irá resultar em uma única banda a ~ 594 pb, enquanto os primers específicos cogongrass irá resultar em nenhuma banda. Porque JBG e reverteu JBG ter seqüência de ácido nucléico idênticos, eles vão, portanto, têm padrões idênticos de bandas. Se muitas amostras devem ser comparados com um gel ao mesmo tempo, é recomendável a execução de todas as amostras derivadas de cada iniciador situado ao lado um do outro, tornando assim mais fácil para digitalizar as amostras para resultados positivos. Diferenças morfológicas entre JBG e reverte JBG são bastante óbvios (cor vermelha por exemplo, das folhas e menor estatura de JB G vs a coloração verde, maior estatura e crescimento agressivo do JBG reverter), de modo enquanto os resultados da PCR será o mesmo, as variedades JBG são fáceis de distinguir usando morfologia da planta. Figura 1. Comparação de estufa cresceram Imperata cylindrica var. Koenigii (grama sangue japonês), revertidas I. cylindrica var. koenigii (JBG Revert) e I. cylindrica (tipo selvagem cogongrass). Figura 2. Um exemplo de amostras de ADN verificada utilizando um espectrofotómetro NanoDrop. Note-se que, independentemente do espectrofotómetro utilizado, o rácio 260/280 deve ser próximo de 1,8 eo rácio 260/230 deve fechar a 2,0. ONTEÚDO "> As amostras de DNA Figura 3. Verificada usando electroforese em gel de padrão em um gel de agarose a 1%. Um marcador de ADN comercial foi utilizado para análise de tamanho. Lane # 4 é um exemplo de amostra pobre qualidade do DNA, mostrando manchas e alguma contaminação RNA. Alinhamentos Figura 4. Seqüência das regiões trnL-F de Imperata cylindrica var. Koenigii (grama sangue japonês), revertidas I. cylindrica var. koenigii (JBG Revert) e I. cylindrica (tipo selvagem cogongrass). Vertical setas pretas indicam diferenças nas sequências resultantes de SNPs e indels. Horizontais setas verdes indicam as posições dos iniciadores de tipo selvagem cogongrass utilizados para cogongrass-PCR específica. Horizontais setas vermelhas indicam a posições da JBG e JBG Reverter iniciadores utilizados para JBG-PCR específica. Figura 5. Resultado representativas de electroforese em gel dos produtos de PCR derivados de cogongrass, JBG e JBG reverter amostras de DNA combinados com cogongrass-e JBG primers específicos, bem como a trnL-F de controlo positivo e um controle de modelo não negativo.