Predicción del VIH-1 usos correceptor (tropismo) por análisis de secuencia utilizando un enfoque genotípica

El protocolo se resume en la figura. 4. 1. Colección de muestras de sangre Recoge al menos 3 ml de sangre en tubos con EDTA en el centro clínico. Las muestras se pueden almacenar hasta por una semana a 4 ° C. Envíe las muestras de sangre con EDTA, lo antes posible al laboratorio por correo ordinario. 2. Aislamiento de ARN de VIH y / o ADN Obtener ARN viral y / o de ADN de 1000 l de sangre entera, suero o plasma, utilizando el MagNA Pure Aislamiento compacto Nucleic Acid I kit I y el MagNA Pure sistema compacto. Eluir el ganado ARN o ADN en 50 l de tampón TE. Alternativamente, otros procedimientos de purificación de ácidos nucleicos pueden ser utilizados. 3. La amplificación de la región env Amplificar la región env (Figs. 2 y 4) o bien a partir de plasma de ARN o ADN proviral. A 1245 bp de largo producto, que comprende la mayoría de la proteína Env (nt 6556-7811 according a HXB2) se genera. RNA de muestras: RT-PCR Viral ARN presenta una estructura secundaria muy complejo (Fig. 4) que puede dificultar la reacción de RT. Para evitar este problema, incubar 10 ARN mu l a 65 ° C durante 10 minutos (ya en el tubo de PCR y PCR en la máquina) y luego reducir la temperatura a 50 ° C. Añadir 40 l de la mezcla maestra de PCR incluyendo los cebadores Env-F y R-Env. Master Mix para la RT-PCR In-House-System: volumen / reacción (l) concentración final RNasa libre de H 2 O 14,4 Tampón 5x (Qiagen OneStep RT-PCR Kit) 10 1x 5x Q-Solution 10 1x dNTP Mix (10 mM cada uno) <td> 2 400 mM de cada dNTP Enzym-Mix (Qiagen OneStep RT-PCR Kit) 2 Primer Env-F (100 mM) 0,3 0,6 mM Primer Env-R (100 M) 0,3 0,6 mM Inhibidor de RNasa (RNasin) 1 5 unidades / reacción Env-F: 5'-3 '(CAAAGCCTAAAGCCATGTGTAAA nt 6556 → 6586 de acuerdo con HXB2) Env-R: 5'-3 '(AGTGCTTCCTGCTGCTCCTAAGAACCC nt 7785 ← 7811) Ejecutar la reacción RT a 50 º C durante 30 minutos. Ejecutar la primera PCR de la siguiente manera: 95 ° C, 15min 1 x 95 ° C, 30 seg 50 ° C, 30 seg 72 ° C, 2 min </td> 1 x 95 ° C, 30 seg 56 ° C, 30 seg 72 ° C, 2 min 38 x 72 ° C, 10 min 4 ° C ∞ Las muestras de ADN PCR: reacción Para muestras de ADN proviral, no inicial de reacción de RT se necesita, y la reacción de PCR puede iniciar directamente. Añadir 40 l de PCR Master Mix a 10 l de ADN Provial. Master Mix para PCR In-House-System: volumen / reacción (l) concentración final RNasa libre de H 2 O 15,4 Tampón 5x (Polimerasa HotStarTaq ADN) 10 1x 5x Q-Solution 10 1x dNTP Mix (10 mM cada uno) 2 400 mM de cada dNTP Enzym-Mix (Polymerase HotStarTaq ADN) 2 Primer Env-F (100 mM) 0,3 0,6 mM Primer Env-R (100 M) 0,3 0,6 mM Env-F: 5'-3 '(CAAAGCCTAAAGCCATGTGTAAA nt 6556 → 6586) Env-R: 5'-3 '(AGTGCTTCCTGCTGCTCCTAAGAACCC nt 7785 ← 7811) Ejecutar las condiciones de PCR descritas anteriormente para las muestras de ARN (Paso 3.1.4). 4. La amplificación de la región V3: PCR anidada Para la PCR anidada, utilizar 5 l de la primera reacción de PCR (sin análisis previo en gel de agarosa) como plantilla y añadir 95 l de PCR MasMezclar ter. Master Mix para Nested-PCR In-House volumen / reacción (l) concentración final H 2 O 61,9 10x tampón PCR 10 1x 5x Q-Solution 20 1x dNTP Mix (10 mM cada uno) 2 200 mM de cada dNTP Primer Env-2F (100 mM) 0,3 0,6 mM Primer Env-2R (100 M) 0,3 0,6 mM ADN Polimerasa HotStarTaq 0,5 2,5 unidades / reacción Env-2F: 5'-3 '(GTCCAAAGGTATCCTTTGAGCCAATTC nt 6838 → 6864) <strong> Env-2R: 5'-3 '(CACCACTCTTCTCTTTGCCTTGGTGGGTGC nt 7712 ← 7742) Ejecutar la PCR de la siguiente manera: 93 ° C, 15min 1 x 95 ° C, 30 seg 50 ° C, 30 seg 72 ° C, 90 seg 1 x 95 ° C, 30 seg 56 ° C, 30 seg 72 ° C, 90 seg 43 x 72 ° C, 10 min 4 ° C ∞ Analizar el producto de PCR en un gel de agarosa al 1% (Fig. 4). El producto esperado es 902 bp de largo. La purificación de las muestras de secuenciación. Se purifica el producto de PCR con el Qiagen PCR kit de purificación, utilizando el protocolo, soluciones y columnas micro-suministrado por el proveedor. Eluir en 30-100 l tampón PE, en función de la intensidad de la banda. Alternativamente, las muestras pueden purificarse usando ExonucleasaI y Fast AP (Thermo fosfatasa alcalina). Para este propósito, añadir 6 l Exo-AP Mix a 15 l de producto de PCR y se incuba 15 minutos a 37 ° C. 580 l H 2 O 66 l rápido AP 13,4 l I Exo 5. Secuencia de reacción de la amplificación V3 La secuencia de reacción consiste en una reacción de PCR usando sólo uno de los cebadores siguientes: Env-2: 5'-GTACAATGYACACATGGAATTAGGC -3 (nt 6959 → 6980) Env-5: 5'-AAAATTCCCCTCCACAATTA – 3 '(nt 7352 ← 7371) Env-6: 5'-GGCCAGTAGTATCAACTCAAC – 3 '(nt 6979 → 7000) Env-7: 5'-TGTCCACTGATGGGAGGGGC – 3 '(nt 7530 ← 7549) Env-10: 5 '- GCAGAATAAAACAAATTATAAACATGTGGC – 3' (nt 7478 ← 7507) Env-11: 5 '- TACATTGCTTTTCCTACTTTCTGCCAC – 3' (nt 7638 ← 7664) Cebadores de primera elección son: Env-2, Env-6 o 7-Env, Env-11 Usar 1 l del amplicón V3 purificado como molde y añadir 9 l de mezcla maestra de PCR. Secuenciación Mix Master: 4 mix secuencia l (VIH-Genotipado Kit) 4 l H 2 O 1 Primer l (100 pmol / l) Ejecutar la secuencia de reacción como sigue: 96 ° C, 10 seg 50 ° C, 10 seg 36 x 60 ° C, 45 seg 4 ° C ∞ 6. La purificación de las muestras de secuenciación Purificar secuencias using Sephadex G-50 superfino. Rellene el número adecuado de pozos en el "cargador columna" con Sephadex G-50 superfino. Transferir el Sephadex al MAHVN4510 placa de filtro, girando de nuevo. Añadir 300 l Milli-Q H 2 O a cada pocillo de la placa de filtro, y se incuba durante al menos 3 horas a 2-8 º C. Centrifugar las placas durante 5 min a 910Xg y 4-15 ° C. Desechar el flujo a través. Añadir 10 l de H 2 O para el producto secuencia y luego pipeta de la secuencia de la placa se hinchó Sephadex. Para obtener el producto purificado, se centrifuga la placa durante 5 min. a 910Xg y 4-15 ° C y se recoge el flujo a través. 7. La secuenciación de las muestras purificadas en el secuenciador ABI Prism 3130 XL Antes de cada ejecución, cambiar el tampón y comprobar el volumen del polímero (POP7). Si es necesario, reemplazar el matraz polímero viejo por uno nuevo. Utilice las condiciones de ejecución guardados, incluyendo un tiempo de inyección de 18 segundos. En esta máquina, la recopilación de los datos de la señal de un ensayo con 16 muestras de la secuencia tarda aproximadamente 60 min (36 cm capilar) o 150 min (50 cm capilar). 8. Secuencia de edición Utilice el programa Lasergene (ADN-Star) para alinear y editar las secuencias (Fig. 5). Otros programas de edición de secuencias puede ser utilizado. Use un "Consenso V3-B" y la secuencia de consenso env como referencias. Lasergene crea una secuencia de consenso de la muestra analizada utilizando todos los datos disponibles primas y almacenarlo como archivo FASTA. El archivo FASTA es un archivo de texto que incluye un encabezado con el nombre de la muestra y la secuencia de nucleótidos. 9. Secuenciación interpretación de los datos y la predicción tropismo Secuenciación interpretación de los datos se realiza por el sistema de interpretación basado en la web geno2pheno [correceptor] ( http://coreceptor.bioinf.mpi-inf.mpg.de/index.php). Para la predicción de tropismo, diferentes ajustes de IPA pueden ser seleccionados. La configuración por defecto es de acuerdo a las directrices de terapia alemana-austriaca. Para FPR ≥ 20%, el virus se clasifica como R5 cuando FPR ≥ 20% y X4 para FPR <12,5%. Cargue el archivo FASTA en el servidor. Este servidor traduce la secuencia de nucleótidos en aminoácidos, lo alinea con la secuencia consenso de V3-B y produce una clasificación subtipo. Además, se genera una predicción del uso del correceptor (Fig. 4) expresado como tasa de falsos positivos (FPR). 10. Los resultados representativos El geno2pheno [correceptor] salida muestra una interpretación nivelada de la tropismo. En función de la probabilidad de que el uso del correceptor, el texto de la interpretación y el color de fondo varía de verde (FPR <20%), lo que sugiere una administración segura para MVC, al amarillo, lo que sugiere un posible riesgo, bajo y finalmente a rojo. El rojo es el color sugierenING no prescribir MVC. Además, el servidor genera un informe pdf que se puede imprimir, se rellenó con paciente y datos de la muestra, y se envía al médico. Ejemplos de geno2pheno salida [correceptor] se representan en la figura. 6. Figura. 1. Esquema de la replicación del VIH. El virión debe de unirse a las células CD4 celulares como receptor, y bien en el CCR5 o CXCR4 como correceptor. El correceptor CCR5 puede bloquearse con antagonistas del CCR5 maraviroc (MVC como, Celsentri, Selzentry). Después de la fusión de las membranas viral y celular, la nucleocápside viral se libera en el citoplasma. La nucleocápside desmonta y el complejo ARN viral se libera en el citoplasma. La transcriptasa inversa viral (RT) transcribe el ARN genómico en ADN proviral, que después se transporta al núcleo y se integra en el genoma del huésped por la integrasa del VIH. RNA polimerasas celulares transcribe genómico viral y ARN mensajeros a partir del genoma proviral. Las proteínas virales se produce en el citoplasma y se transportan a la superficie celular. Las partículas de virus brote como inmaduras, no infecciosas viriones de las células. La proteasa del VIH escinde las proteínas productoras de partículas infecciosas. La inhibición de uno de los pasos conduce a una interrupción del ciclo de replicación. Los medicamentos antirretrovirales y el paso que inhiben la replicación están marcados en rojo. El ARN viral y el ADN proviral (material utilizado para el análisis de tropismo o resistencia) están marcadas en verde. Figura 2. Genoma proviral del VIH. La partícula de VIH está construido con diferentes proteínas estructurales y casas de varias enzimas y de proteínas, tanto de origen viral y celular. El programa figuras la localización de los genes en el genoma viral. La superficie de las proteínas gp120 y gp41 constituyen los puntos en la superficie del virión y en contacto con la célula humana para llevar a cabo la fusión de la membrana. En la parte inferior de la figura, los productos de amplificación de PCR y los cebadores utilizados en el protocolo se muestran. Figura 3. Proporción de pacientes con baja carga viral (CV) mediciones analizadas para resistencia a las drogas o la determinación de tropismo en el Instituto de Virología de la Universidad de Colonia (Alemania). Figura 4. Esquema general del experimento .. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra. Figura 5. Secuencia de edición con Lasergene. El amplicón V3 se secuencia con al menos un avance y un cebador inverso. Lasergene alignés los "abi". Archivos obtenidos desde el secuenciador con la referencia de secuencias "Consenso V3-B" y env. Lasergene crea una secuencia de consenso con todos los datos de fila disponibles. Las secuencias de referencia puede ser marcado (y luego se muestran en gris) a fin de que no contribuyen a la secuencia de consenso de la muestra. Figura 6. Informes tropismo de predicción generados por el geno2pheno [correceptor] tool.The informes se generan en formato pdf que se pueden guardar y terminado en el ordenador. Datos adicionales de nombres tales paciente nos, la fecha de extracción de sangre, etc, pueden ser incluidos de forma manual utilizando un programa de grabación de pdf. Observaciones específicas pueden ser también añadido. These Los datos se encuentran exclusivamente en el ordenador del usuario y no en el servidor geno2pheno [correceptor]. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.