원자 힘 현미경을 사용하여 재조합 DNA와 단백질 단지의 시각화
Özet
플라스미드 DNA, 세포질 단백질과 DNA – 단백질 단지의 시각화를위한 감청 모드 원자 힘 현미경 (AFM) 방법을 설명합니다. 방법은 다음과 같은 생화 학적 조작 AFM 이미징을위한 샘플을 준비 대체 방법을 제공합니다. 특정 단백질 상호 작용하는 지역을 포함하는 DNA는 거의 physiologic 버퍼 조건에서 관찰됩니다.
Abstract
원자 힘 현미경 (AFM)은 각각의 단백질, DNA 분자, 단백질 – 단백질 단지, 그리고 DNA – 단백질 단지의 시각을 허용합니다. 현미경의 캔틸레버의 끝에 나노미터에서 micrometers에 이르기까지 탐색 이미지 영역, 특정 시점에서 기판 표면에 휴식 macromolecules의 고도를 측정하는 나노 스케일 프로브가 있습니다. 정전 세력은 느슨하게 무작위 방향으로 기판에 연결하여 영상을 허용하기 위해 단백질, lipids 및 핵산의 원인이됩니다. 생성된 데이터는 macromolecules가 개별 크기 (그림 1) 1,2 세 가지 차원 입자로 해결 지형도, 유사. 태핑 모드 AFM은 DNA와 단백질과 같은 비교적 부드러운 biomaterials의 이미징을 허용 캔틸레버의 반복 진동을 포함합니다. 다른 nanoscale 현미경 기술을 통해 AFM의 주목할만한 장점 중 하나는 실시간으로, 그리고 얼룩이나 코팅 군데로 샘플 않고 가까운 physiologic 버퍼링 조건을 포함한 수성 버퍼, 내의 개별 단백질 및 macromolecular의 단지를 시각화하기 위해 상대적으로 적응성입니다.
여기서 제시하는 방법은 DNA와 버퍼링 솔루션에 immunoadsorbed 전사 인자 (예 : 글루코 코르티 코 이드 수용체, GR) (그림 2)의 이미지에 대해 설명합니다. Immunoadsorbed 단백질과 단백질 단지는 항체 에피토프와 (그림 2A)가 몇 군데와 경쟁하여 immunoadsorbing 항체 – 비드 펠렛 분리 수 있습니다. 이것은 이전 이미지의 관심 biomolecules의 생화학 조작을 허용합니다. 일단 정제, DNA와 단백질을 혼합 수 있으며 결과 상호 작용하는 복합은 물론 몇 군데하실 수 있습니다. 미카에게 DNA의 바인딩이 같은 니켈이 같은 이가의 양이온 3, 필요 + 또는 MG이 단백질의 활동을 유지하고 아직 샘플 버퍼에 추가할 수 있습니다 +. 비슷한 접근법을 사용, AFM은 개인의 DNA 가닥에 바인딩된 RNA 효소 4 수리 효소 5 포함한 개인 효소를 시각화하기 위해 활용되었습니다. 이러한 실험은 단백질 단백질 및 분자 수준에서 일어나는 DNA – 단백질 상호 작용에 중요한 biophysical 통찰력을 제공합니다. AFM과 이미징 개별 macromolecular 입자는 입자 균질성를 결정하고 몇 군데 입자의 구성 요소의 물리적인 배열을 식별하는 데 유용할 수 있습니다. 현재 메서드가 GR가 바인딩할 수있는 GR – 보호자 단백질 단지 1,2와 DNA 가닥의 시각화를 위해 개발되었습니다 있지만, 그것은 다양한 소스로부터 영상 DNA와 단백질 샘플에 널리 적용할 수 있습니다.
Protocol
Discussion
AFM은 실시간으로 수성과 가까운 physiologic 버퍼 솔루션 이미징 개인 uncoated biomolecules 수있는 독특한 미세 기술을 제공합니다. 이것은 각각의 단백질과 DNA의 분자뿐만 아니라 multiprotein의 단지 및 단백질의 DNA 단지의 시각화를위한 수 있습니다. AFM과 이미징 macromolecular 입자는 샘플 균질성 평가와 관찰 입자의 구성 요소의 실제 배열을 식별하는 데 유용할 수 있습니다. 개인 macromolecular 입자를 관찰 이러한 접근 방식은 immunoprecipitation의 assays, polyacrylamide 젤 전기 영동하고, 현재 관심있는 10 세 -10 11 개별 biomolecular의 단지를 나타내는 중요한 summative 데이터를 제공 크기 제외 칼럼 크로마 토그래피로 종래의 생화학 기술에 유용한 부가 될 수 있습니다 샘플 인치
multiprotein 복잡한 stoichiometry, biomolecular 상호 작용, 그리고 cofactor 요구 사항에 대한 연구는 모든 AFM을 사용하여 조사하실 수 있습니다. 여기서 제시하는 방법은 관심의 특정 biophysical 질문을 수용하기 위해 적용할 수 있습니다. 예를 들어, 버퍼를 교환 수있는 액체 세포 프로브 홀더를 사용하여 그것은 복잡한 단백질 형성에 대한 분석 cofactor 요구하는 것이 가능해 질 것입니다. 몇 군데하면서 DNA – 단백질 어셈블리도 거의 실시간 및 형성하고 dissociated 수 있습니다. DNA는 가상 바인딩 단백질과 혼합 관심의 특정 시퀀스 (추정 응답 요소 또는 소설 단백질 바인딩 순서를 예)와 함께 생성하고, 분자간 상호 작용의 직접적인 증거를 제공하기 위해 몇 군데 있습니다.
건조 표본이 아니라 수성 솔루션의 샘플 및 선형 DNA 스탠드 및 폐쇄 원형의 DNA plasmids이 방법으로 3,9 군데있다 모두보다 활용하는 경우 태핑 모드 AFM 이미징은 크게 덜 복잡합니다. 여기서 제시하는 방법은보다 생리적 이미징 환경을 제공하기 위해 버퍼 솔루션 샘플을 활용합니다. 이미지 단백질의 다른 주목할만한 방법은 역시 현장 적외선 현미경 니어 10를 포함하여 고려되어야합니다. AFM과 조화의 immunoadsorption의 보완 사용 잘 설립 생화 학적 기법을 이용하여, 단백질 단지의 무수한를 준비하는 기회를 제공하고, 다음 immunoadsorbing 항체 – 비드 펠렛에서 릴리스 다음을 시각화. 예를 들어, immunoadsorbed GR은 복잡한 크기와 stoichiometries을 추정하기 위해서는이 접근법을 사용이 hsp70 분자 보호자 단백질 일뿐만 아니라 dynein 모터 단백질과의 연관에 대한 assayed되었습니다. 입자 크기와 biophysical 기능 (예 : 강성) AFM 군데 샘플 11,12에서 관찰 biomolecules의 신원을 ascertaining에 유용했습니다. 그것은 대상 생분자가있는 경우 그 대상과 원인 입자 크기 증가에 바인딩 것이 상호 작용 생분자 (예 : 리간드 또는 단클론 항체)의 추가로 생분자 신원을 확인하는 것도 가능합니다.
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 보건 부여 GM086822 국립 연구소에 의해 투자되었다. 저자 DRS 감사하고 싶습니다. 알렉 Pakhomov & 폴 월리스 (워싱턴 나노기술 사용자 시설의 Univ. (NTUF)) 및 전문 기술 지원 안드레아 슬레 이드 (Bruker AXS). DNA AFM 이미징은 대학교에서 실시되었다. 워싱턴 NTUF, 국립 나노기술 인프라 네트워크의 멤버. 2xGal4 – 2xGRE – luciferease 플라스미드는 친절 박사 키스 야마모토 (캘리포니아 Univ., 샌프란 시스코)의 실험실에 의해 제공되었다.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| Dimension 3100 | Bruker | Dimension 3100 |
| Dimension Fluid Cell | Bruker | DTFML-DD-HE |
| Sharp nitride lever (SNL) silicon nitride AFM probe | Bruker | SNL-10 |
| Microlever sharp nitride lever (MSNL) silicon nitride AFM probe | Bruker | MSNL-10 |
| NanoScope AFM instrument software | Bruker | 004-132-000 |
| Metal AFM specimen discs | Ted Pella | 16208 |
| Grade V1 Mica Discs, 12 mm | Ted Pella | 50-12 |
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