הידרופובי אוטומטי אינטראקציה כרומטוגרפיה טור בחירה עבור שימוש ב טיהור חלבון
Özet
שיטה אוטומטית לזיהוי מתאימים הידרופובי כרומטוגרפיה אינטראקציה (היק) התקשורת כדי לשמש בתהליך של טיהור חלבון מוצג. השיטה משתמשת בינוני הלחץ כרומטוגרפיה נוזלית כולל מערכת מיזוג חיץ אוטומטי, הזרקת לולאה דגימה דינמי, בחירת העמודה רצף, רב גל ניתוח, חלק פיצול אוסף eluate.
Abstract
בניגוד לשיטות אחרות chromatographic טיהור חלבונים (למשל סינון בג'ל, זיקה, ואת חילוף יונים), כרומטוגרפיה אינטראקציה הידרופובי (היק) בדרך כלל דורש נחישות ניסיוני (המכונה ההקרנה או "צופיות") על מנת לבחור את המדיום המתאים ביותר chromatographic לטיהור חלבון נתון 1. השיטה המוצגת כאן מתארת גישה אוטומטית צופיות, לתקופה של התקשורת היק אופטימליים כדי לשמש טיהור חלבונים.
היק מפריד חלבונים ביומולקולות אחרים lysate גולמי על בסיס הבדלים hydrophobicity. בדומה זיקה כרומטוגרפיה (AC) ואת חילוף יונים כרומטוגרפיה (IEX), היק מסוגל לרכז את החלבון של עניין תוך כדי התקדמות בתהליך chromatographic. חלבונים המתאימים ביותר על ידי היק לטיהור כוללים את אלה עם אזורי משטח הידרופובי ומסוגל לעמוד החשיפה מלח בריכוז העולה על תחמושת מ 2nium סולפט ((NH 4) 2 SO 4). היק נבחר לעתים קרובות כשיטה טיהור חלבונים חסרי זיקה תג, ואינם מתאימים ולכן על AC, וכאשר IEX אינה נותנת טיהור נאותה. Moieties הידרופובי על פני החלבון באופן זמני להיקשר ליגנד פולרי מצמידים את מטריקס, נייח נייח. האינטראקציה בין חלבונים ליגנד הם תלויים במידה רבה על ריכוז מלח למאגר זורם דרך העמודה כרומטוגרפיה, עם ריכוזים יוניים גבוהים לחיזוק האינטראקציה חלבונים ליגנד ולהפוך את החלבון נייח (כלומר כבול בתוך הטור) 2. כמו ירידה בריכוז המלח, אינטראקציה חלבון ליגנד מתפוגג, חלבון שוב הופך נייד elutes מהעמודה. התקשורת היק כמה זמינים מסחרית מראש ארז עמודות, שכל אחת מהן מכילה 1 של ligands הידרופובי מספר (למשל S-בוטיל, בוטיל, octyl, ואת פניל) צולבים על צפיפויות שונות כדי חרוזים agarose של המפרטific בקוטר 3. טור אוטומטי צופיות מאפשר גישה יעילה בקביעת היק התקשורת צריכה להיות מועסק על ניסויים עתידיים, אופטימיזציה ממצה יותר וטיהור החלבון מפעילה 4.
החלבון הספציפי מטוהרים כאן הוא רקומביננטי חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP), אולם הגישה יכול להיות מותאם לטיהור חלבונים אחרים עם אחד או יותר אזורים משטח הידרופובי. GFP חלבון משמש מודל שימושי, בשל יציבותו, ספיגת ייחודי שיא האור 397 ננומטר, ואת הקרינה בעת חשיפה לאור UV 5. Lysate בקטריאלי המכיל GFP סוג בטבע הוכן מאגר גבוהה מלח, נטען לתוך ביו רד הלחץ DuoFlow מערכת בינונית כרומטוגרפיה נוזלית, ואת ספוחים לסחף נחלי לטורים המכילים HiTrap היק היק מדיה שונים. חלבון היה eluted מן העמודים ונותחו על ידי line-in ופוסט להפעיל שיטות זיהוי. מיזוג חיץ, הזרקת לולאה דגימה דינאמית, קול רציףהבחירה umn, רב גל ניתוח, חלק פיצול אוסף גדל eluate את הפונקציונליות של המערכת, שחזור של גישה ניסויית.
Protocol
Discussion
טכניקות כרומטוגרפיה נוזלית הוכיחו ערך רב להכנת חלבונים מטוהרים מאוד הדרושים לביצוע 6 החיסונית, ביוכימי 7, 8 מחקרים מבניים. שיטות טיהור היק לרוב דורשים קביעת אמפירית של המדיום המועדף, והמבנה ליגנד, צפיפות ליגנד, ואת מטריקס תכונות חרוזים כל הוכחו להשפיע על תוצאות chromatographic 2, 3. טור אוטומטי צופיות היא גישה יעילה לבחירת בינוני היק לאופטימיזציה לאחר וטיהור חלבון 4. שיטת הטור אוטומטי צופיות הציג ניתן להתאים בקלות אסטרטגיות שונות טיהור היק חלבון. שינויים בריכוז המלח, הבחירה מלח, צבע מלח, pH עשוי לשפר עוד יותר את התנאים טיהור, ואת ההשפעות של משתנים אלה פרמטרים חיוניים נבדקו קודם לכן 13,14. Eluate היק המכיל prote היעד מטוהרים חלקיתב יכול להיות מטוהרים יותר בטכניקה chromatographic משלימים, כגון חילוף יונים כרומטוגרפיה (IEX) או סינון / גודל ג'ל הרחקת כרומטוגרפיה 9,10.
בגלל ספיגת אור ייחודי ומאפיינים פליטה, פרופיל elution של ה-GFP ניתן לזהות שימוש ב-line ופוסט להפעיל גישות. לשם כך, פרוטוקול זה יכול עוד להיות מותאם לטיהור של ה-GFP-Fusion חלבונים רקומביננטיים, שבו חלבון המטרה קשור הוא "מסומן" עם ה-GFP. חלבונים היעד GFP-מתוייגים ניתן לאתר עם האור האולטרה סגול 11 ו מטוהרים באמצעות גישות chromatographic שונים, כולל אסטרטגיה טיהור היק שתואר לעיל. טיהור GFP הפך גם מצרך פדגוגית במעבדות ביוכימיה ללימוד טכניקות מודרניות מדע חלבון 12.
בעוד חלבון בסיסי טיהור היק ניתן לבצע באמצעות החזקה משמעותית פחות כרומטוגרפיה סאיגזע, מכשור המוצג כאן יש מספר יתרונות ברורים על מנת לסייע בהשגת תוצאות חיוביות. היתרונות הבולטים של ניצול מערכת אוטומטית ביותר כוללים שיפור לרוץ אל הפעל מצב, שחזור זמן חיסכון, וירידה הזדמנויות אוויר שיש להזין למערכת 10. מערכת מיזוג מבוקר חיץ, אשר בהנחייתם של Maximizer המערכת, מאפשרת עקביות מוגברת לקראת חיץ שחזור ניסיוני. ציור מטען מדגם מספיק לתוך לולאה דגימה דינמי לכל צופיות פועל עוד יותר מבטיחה אחידות המדגם להתווסף כל עמודה ומאפשר פועל ברצף ללא הפרעה או הוראות מחדש. הזרקה מדגם מבוקר מ לולאה דגימה על הטור מקטין שונות שעלולות להתרחש עם טעינת מדגם ידני. זוג שסתומים הבחירה עמודה לאפשר פועל מדגם רצופים, כל אחד באמצעות עמודת היק אחר, מבלי replumb המערכת. ביצוע מול TI גל ניתוח מועילה במיוחד כאשר מנסה לאמוד חלבון עם פרופיל spectrophotometric ייחודי. בנוסף ה-GFP, cytochromes, flavoproteins, ושאר heme המכיל חלבונים עשויים להפיק תועלת טכניקה זו. מוליכות ו-pH מערכות התראה לאפשר אימות בזמן אמת תנאי הניסוי. חלק פיצול אוסף eluate מאפשר טיפול חלק משופרת המאפשרת העברה קלה לאחר להפעיל שיטות ניתוח הדורשים נפח דגימה מינימלית (למשל ELISA, SDS-PAGE, המערבי כתם, ו אלקטרופורזה Experion microfluidic). בזמן ההפעלה מחובר 2 אספן חלק דורש סנכרון ידני, היא מאפשרת גמישות מרבית בבחירת אספן חלק. החסרונות המשמעותיים ביותר תוך ניצול מערכת כזו כרומטוגרפיה חזקים עבור עמודה היק צופיות וטיהור חלבון כולל את פרק הזמן הראשוני ההוצאות התקציביות הכרוכות ברכישת מכשיר והכשרה של המפעיל.
t "> פרוטוקול שהוצג מנצל מערכת ביו רד DuoFlow כרומטוגרפיה,. עם זאת, מכשור חזקים באותה מידה של יצרנים אחרים, כגון Avant אקטע מ GE Healthcare, עשוי גם להיות מנוצל ולא מסוגלים לייצר תוצאות מקבילות כרומטוגרפיה דומה גם במערכת יש מאפיינים ייחודיים (כגון: תכנות, מגבלות שיטת המינוח רכיב, עדיפות למפעיל, ויכולת הרחבה) כי יש לשקול לפני ביצוע הליך טיהור או רכישת מכשיר.Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו מומנה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות מענק GM086822 ואת הקרן הלאומית למדע גדולה מכשור מענק מחקר DBI-0960313. המחברים מודים בני הזוג. ג'ון מיאקה & דונה הארדי (BIO-RAD) וג'ניפר Loertscher (אוניברסיטת סיאטל) עבור המומחיות הטכנית שלהם. בחר ריאגנטים כרומטוגרפיה ומכשור משלימה נמסרו בנדיבות על ידי Bio-Rad.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| BioLogic DuoFlow Pathfinder 20 System | Bio-Rad | 7602257 | Includes system maximizer, mixer, F10 workstation, AVR7-3 valve, QuadTec UV/Vis detector with flow cell, BioFrac fraction collector, BioLogic software, and starter kit |
| AVR9-8 stream-select valve | Bio-Rad | 7600408 | High-pressure valve, 9-port, 8-position, 3,500 psi (233 bar) limit, for use with BioLogic DuoFlow system |
| Diverter valve SV3T-2 | Bio-Rad | 7600410 | Solenoid valve, 3-port, 2-position, 30 psi (2 bar) limit, for use with BioLogic DuoFlow system |
| Stream splitter valve | Bio-Rad | ||
| DynaLoop 25 Kit | Bio-Rad | 7500451 | Sliding-piston sample loop kit, includes 25 ml DynaLoop sliding piston loop, DynaLoop parts kit (#750-0450) |
| BioFrac Fraction Collector | Bio-Rad | 7410002 | Two fraction collectors used |
| BioFrac microplate drop head adapter | Bio-Rad | 7410088 | |
| BioFrac microtiter plate adapter | Bio-Rad | 7410017 | |
| UV Optics Module | Bio-Rad | 7500202 | |
| Halogen lamp | Bio-Rad | 7601331 | |
| Econo Gradient Pump | Bio-Rad | 7319001 | gradient pump for low-pressure protein purification, includes tubing and fittings kit |
| Experion System | Bio-Rad | 7007001 | |
| Experion Pro260 Analysis Kit | Bio-Rad | 7007102 | |
| HiTrap HIC column selection kit | GE Healthcare | 28-4110-07 | Includes 7 x 1 ml pre-packed columns of HIC media for scouting |
| GE Healthcare-to-Bio-Rad column fittings | GE Healthcare | 18111251 and 18111257 |
Referanslar
- Cummins, P. M., O’Connor, B. F. Hydrophobic interaction chromatography. Methods Mol. Biol. 681, 431-437 (2011).
- Nagrath, D., Xia, F., Cramer, S. M. Characterization and modeling of nonlinear hydrophobic interaction chromatographic systems. J. Chromatogr. A. 1218, 1219-1226 (2011).
- To, B. C., Lenhoff, A. M. Hydrophobic interaction chromatography of proteins. IV. Protein adsorption capacity and transport in preparative mode. J. Chromatogr. A. 1218, 427-440 (2011).
- Huddleston, J. G., Wang, R., Lyddiatt, A. On the use of mild hydrophobic interaction chromatography for “method scouting” protein purification strategies in aqueous two-phase systems: a study using model proteins. Biotechnol Bioeng. 44, 626-635 (1994).
- Arun, K. H., Kaul, C. L., Ramarao, P. Green fluorescent proteins in receptor research: an emerging tool for drug discovery. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 51, 1-23 (2005).
- Terrizzi, S. C., Banh, C., Brossay, . L.A Protocol for the Production of KLRG1 Tetramer. J. Vis. Exp. (35), e1701-e1701 (2010).
- Murphy, P. J. M., Morishima, Y., Kovacs, J. J., Yao, T. P., Pratt, W. B. Regulation of the dynamics of hsp90 action on the glucocorticoid receptor by acetylation/deacetylation of the chaperone. J. Biol. Chem. 280, 33792-33799 (2005).
- Zeytuni, N., Zarivach, R. Purification of the M. magneticum strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamAΔ41. J. Vis. Exp. (37), 10-3791 (2010).
- Kong, Y., Li, X., Bai, G., Ma, G., Su, Z. An automatic system for multidimensional integrated protein chromatography. J. Chromatogr. A. 1217, 6898-6904 (2010).
- Camper, D. V., Viola, R. E. Fully automated protein purification. Anal. Biochem. 393, 176-181 (2009).
- Hammon, J., Palanivelu, D. V., Chen, J., Patel, C., Minor, D. L. A green fluorescent protein screen for identification of well-expressed membrane proteins from a cohort of extremophilic organisms. Protein Sci. 18, 121-133 (2009).
- Wu, Y. Using green and red fluorescent proteins to teach protein expression, purification, and crystallization. Biochem. Mol. Biol. Educ. 36, 43-54 (2008).
- Queiroz, J. A., Tomaz, C. T., Cabral, J. M. Hydrophobic interaction chromatography of proteins. J. Biotechnol. 87, 143-159 (2001).
- McCue, J. T. Theory and use of hydrophobic interaction chromatography in protein purification applications. Methods Enzymol. 463, 405-414 (2009).
