Geautomatiseerde hydrofobe interactiechromatografie Kolomselectieopties voor gebruik in Protein Purification

1. Buffer en Monstervoorbereiding Technische noot: Alle buffers moeten worden gekoeld en elke stap van dit protocol moet uitgevoerd op ijs of bij 4 ° C worden, tenzij anders vermeld. De lage temperatuur is essentieel om afbraak van het eiwit te zuiveren voorkomen en een optimale werking te garanderen. HIC media kunnen tot verschillende scheiding resultaten bij gebruik op kamertemperatuur en chromatografie systeem dient in een 4 ° C koude kamer of koud vak. Bereid 500 ml van de volgende buffers: 200 mM NaH 2 PO 4 (Buffer A1), 200 mM Na 2 HPO 4 (Buffer A2) en 4,8 M (NH4) 2 SO 4 (Buffer B2). Gedeïoniseerd water (Buffer B1) ook worden gebruikt. Degas de buffer om een ​​optimale chromatografische omstandigheden te garanderen. Het systeem Maximizer zal mengen samen Buffers A1 en A2 naar een lage-zout fosfaat elutiebuffer genereren, en het zal Buffers B1 en B2 mengende hoge-zout ammoniumsulfaat start buffer (2,4 M (NH4) 2 SO 4) genereren. Bereid 20 ml monster te laden door 10 ml cellysaat die het eiwit te zuiveren met 10 ml buffer B2. De uiteindelijke ammoniumsulfaatconcentratie van het cellysaat monsteroplossing dient ongeveer 2,4 M (NH4) 2 SO 4, waardoor ongeveer gelijk aan het begin buffer. Cellysaat kunnen worden bereid door mengen van de bacteriële celpellet in TE buffer (10 mM Tris 1 mM EDTA, pH 8,0), gevolgd door sonificatie of de toevoeging van 1 mg / ml lysozym en centrifugatie bij 3700 g gedurende 10 minuten. Filter het lysaat-buffer mengsel door een laag eiwit bindende 0,45 pm filter injectiespuit deeltjes uit de oplossing. Houd het monster op het ijs tot hij klaar om te worden geladen in het systeem. 2. Fysieke Setup en Sanitair van DuoFlow chromatografiesysteem Zorg ervoor dat alle voeding van het apparaat en de communicatie aansluitingen zijn gemaakt. Apparaten moeten zichtbaar zijn in de biologische DuoFlow chromatografie software handmatige bediening venster. Een samenvatting van inrichtingen zijn vermeld in tabel 1. Een illustratie van het systeem en leidingen diagram in figuur 2. Bevestig de elektrische aansluitingen voor de kleppen aan de pomp werkstation en het systeem maximizer-poorten, zodat de haven nummering een logische volgorde volgt. Label elke klep met de betreffende poortnummer voor toekomstig gebruik. De pomp werkstation en het systeem Maximizer dienen als belangrijkste communicatie verbindingen tussen de computer / sturing en chromatografie-systeem. Afsluiters zal automatisch worden herkend en weergegeven in de software bij aansluiting op een apparaat. Technische noot: Hoewel het gebruik van de chromatografie-systeem in de handmatige modus, kleppen gescheiden regelbaar zijn. Zorg om te controleren of de gewenste stroombaan is geconfigureerd, met name bij het schakelen kleppen, alvorens buffER stromen. Dompel Teflon slang in Buffers A1, A2, B1, en B2. Zorg voor voldoende volumes van buffer zijn beschikbaar voor de gehele protocol en dat de slangen zullen blijven onder water. Voorbereiden van 500 ml Buffers A1, A2 en B2 en 1 liter buffer B1 zal voldoende zijn. Plumb monster laden klep dynamische monsterlus zoals geïllustreerd in figuur 2 per fabrikant. Sluit het monster lus om het monster klepinlaat (Positie 3) met de kleinste lengte van de slang mogelijk. Dit zal monsterverdunning tijdens belading van het monster proces. Minimaliseer de lengte van de leidingen tussen het monster, monster laden pomp, en sample laden inlaat (positie 2). Hierdoor neemt de hoeveelheid monster nodig is om de monsterlus laden. Bereid 8 even grote paren van 1/16 "OD PEEK slangen, met elk paar met elkaar verbonden door een 1/4-28 female-to-1/4-28 vrouwelijke unie. Sluit de paren om Posities 1-8 van de twee kolommen selectie kleppen. De 7 unieis verbonden in-line kolom keuzeklep posities 2-8 zal later worden vervangen door chromatografiekolommen te testen. De vereniging is aangesloten in lijn met Positie 1 zal worden gehandhaafd als een chromatografiekolom bypass. Technische noot: Zorg ervoor dat elk paar van de slang is aangesloten op dezelfde positie op zowel kolom selectie kleppen. Schakel zowel de 4-golflengte UV / Vis Detector (QuadTec) lamp en een vaste golflengte 280 nm UV-detector lamp. De golflengten te meten door de QuadTec voor dit protocol zijn onder andere 214 nm, 280 nm en 397 nm. Het meten van 280 nm met zowel de vaste-golflengte UV-detector en QuadTec biedt redundantie van het systeem en zorgt voor de validiteit ervan. Bevestig alle detectoren zijn gekalibreerd volgens de instructies van de fabrikant. De regelaar moet luchtbel accumulatie verminderen detectoren worden geplaatst stroomafwaarts van de detektoren, maar stroomopwaarts van de pH monitor. Het systeem hier beschreven uit twee fractin verzamelaars, die een wezenlijke gemak voorziet in post-run eluaat analyse. Bevestig de fractie verzamelaars, stroom splitter klep, en splitter controller zoals geïllustreerd in figuur 2. De fractie kollektor met een van de splitser klepstand verzamelen 900 ul fracties in 12 eluaat ml kweekbuizen, terwijl de fractie collector verbonden positie 2 verzamelen 100 pi eluaat fracties in 96-well microtiter platen. De Positie 2 fractiecollector, splitter klep, en splitter regelaar worden bediend offline van de chromatografie werkstation. De splitter regelaar binnen een Bio-Rad Econo Gradient pomp, maar de pomp element van de inrichting niet wordt gebruikt. Een "% Split"-instelling optie wordt weergegeven op het Econo Verloop Pomp wanneer de splitter klep is aangesloten. Stel% Split tot 10. De positie een fractiecollector verzamelen 90% van het eluaat (900 ul / fractie) en de positie 2 fractiecollector verzamelt10% (100 ul / fractie). De fractie collectoren vooraf synchroon waardoor fractie aantal beide collectors overeenkomen met elkaar. Vervang de standaard fractiecollector druppel hoofd op de positie 2 fractiecollector met een microplaat druppel hoofd. De microplaat druppel hoofd heeft een kleiner diafragma, die verzameling is het mogelijk van 50% kleinere daling maten (bijv. 25 ui in plaats van de standaard 50 pl) en is met name handig wanneer het verzamelen van ≤ 500 pi fracties. Met behulp van de op het scherm bedieningspaneel, stelt u de positie 2 fractiecollector om breuken in 96-well platen en vooraf te verzamelen met een snelheid van 1 monster / minuut. De splitter controller en Positie 2 fractiecollector zal handmatig worden gestart direct na de start van de eerste chromatografie run. Spoel de Positie 2 fractiecollector en microplaat druppel hoofd met Buffer B1. 3. Priming systeem Lines, programmeren run methode, en EquilibratING HIC Columns Met het systeem Maximizer inlaat lijnen ondergedompeld in ontgast Buffers A1, A2, B1, en B2, prime het werkstation pompen, spoel monster loop, en spoel de chromatografie-systeem volgens de instructies van de fabrikant. Compleet priming stap met alle 4 de maximizer systeem inhammen (A1, A2, B1 en B2) om de resterende luchtbellen te verwijderen. Voorbereiden van het systeem vereist handmatige bediening van het systeem regelaar via de BioLogic software. Bevestig de juiste positionering van het monster belasting klep en kolomselectie kleppen vóór het begin van buffer stromen. Bereid u voor om een ​​handleiding 1 ml / minuut stroom van elutiebuffer (0% B) te beginnen door het systeem, zoals beschreven in de stappen 3.4-3.5. In het Setup-venster van de biologische programma software, selecteert u "Buffer Blending" en "fosfaatbuffer met ammoniumsulfaat". Bevestig Buffers A1, A2, B1, B2 en vermeld in het Setup-venster komen overeen met die voorbereid. Handmatig instellen van het debiet van 1 ml / minuut elutiebuffer(0% B). Let tegendruk, geleidbaarheid, UV-traces, en pH consistent blijven en binnen de normale grenzen. Afwijkingen geven aan lucht of kolom blokkade die moeten voorafgaand aan de procedure worden aangepakt. Spoel alle 8 kolom selectielijnen met 5 ml elutiebuffer. Doe dit door eerst het stoppen van de stroom, het instellen van zowel kolom selectie kleppen naar Positie 2 en hervatting van de 1 ml / minuut stroom, 0% B. Herhaal dit voor kolomselectie lijnen in Posities 3-8. Sluit 1 ml HiTrap HIC kolommen Posities 2-8 van kolom selectie kleppen. Compleet stappen 3.8-3.13 met een kolom per keer. Let op dat HIC kolom wordt geplaatst, waarin keuzeklep positie. Een samenvatting van de HIC kolom media kenmerken is opgenomen in tabel 2. De fysieke aansluiting van GE Healthcare HiTrap kolommen aan de Bio-Rad DuoFlow systeem vereist een serie armaturen gebruik te maken van 1/4-28, M6, en Luer beslag. Verwijder de vakbond het aansluiten van de Positie 2 kolomselectie kleppen. Eenlign de Bio-Rad en GE Healthcare fittingen zoals geïllustreerd in figuur 3. Bevestig upstream kolom fittingen aan de DuoFlow. Vermijd luchtbellen in de kolom of de slang door stevig bevestigen van de upstream-kolom fittingen van de upstream-keuzeklep fitting. Ren elutiebuffer door het beslag totdat alle lucht is verdwenen en een grote daling van de buffer aanwezig is. Tijdelijk stoppen met buffer stromen. Verwijder de stop met de kolom verbonden inlaat en plaats een druppel zoutarme buffer (0% B) aan de bovenzijde van de kolom. Bevestig de kolom aan de upstream-fittingen. Met zowel de kolom inlaat en inlaatfitting vol met druppels buffer zorgt voor een verbinding zonder luchtbellen. Als de kolom wordt gebruikt voor de eerste keer breek de kolomuitlaat einde. Bevestig de uitlaat op de downstream-kolom fittingen en keuzeklep buizen. Controleer of alle koppelingen goed worden vastgedraaid. Stel de tegendruk te beperken tot 40 psi. Was de kolom wi 5 kolomvolumes (5 kolomvolumes = 5 ml) elutiebuffer (0% B) bij een stroomsnelheid van 1 ml / minuut. Ga verder kolom wassen, indien nodig, tot pH, UV-traces en de tegendruk hebben gestabiliseerd. Waskolom met 10 kolomvolumes (10 ml) start buffer (100% B) bij een stroomsnelheid van 1 ml / minuut. Verder kolom was eventueel tot systeem parameters in de vorige stap en geleiding zijn gestabiliseerd. Het HIC bereide kolom hierboven is nu klaar voor sample laden. Zodra alle kolommen te testen worden bereid, handmatig de kolom selectie kleppen naar Positie 1 (unie) en stoppen buffer stromen. 4. Sample Loading Dompel monsterinlaat slang in 20 ml monster om het proces van laden monster begint in de dynamische monster lus. Van de handmatige instelling raam van de biologische software, schakelt monsterlus belasting / wassen klep naar Positie 1 (voorbeeld) en het monster laden klep te zuiveren. Start actie vande monsterlus laden pomp opstelling monster in de pompslang een stroomsnelheid van 1 ml / minuut totdat onmiddellijk na monster bereikt monster laden klep. Dit verwijdert buffer en / of lucht uit het monster gemeten. Stop de stroom van de laad-pomp en zet het monster laden klep van Purge om te laden. Start de monsterlus laden pomp met een stroomsnelheid van 1 ml / minuut tot 10 ml monster getrokken in de dynamische monsterlus. Voldoende monster wordt nu geladen in het dynamische monster lus voor maximaal 10 opeenvolgende HIC kolom scouting runs. 5. Het programmeren van de software methode en uitvoeren van de kolom Scouting Protocol Vanuit het Setup-venster op de BioLogic software, kies de systeem-apparaten met een asterisk in tabel 1. Selecteer 6 HIC kolommen test. Programma een lineaire dalend zoutgradiënt en 6 kolom scouting methode zoals weergegeven in tabel 3. De methode programma is modification van de biologische software HIC kolom setup en is geoptimaliseerd voor de huidige toepassing. Een zes kolommen scouting methode wordt aanbevolen door fractieverzamelaar beperkingen. Alle 7 kolommen kunnen worden gescout als het programma methode aangepast grotere fractie volumes verzamelen. Voeg de scouting stap totdat het programma is anders compleet, zoals het selecteren van de scouting-functie verhindert verdere bewerking. Begin de scouting run. Handmatig beginnen start buffer (100% B) stroom 1 ml / minuut. Druk op start op de splitter controller tot 90% -10% eluaat stroom-splitsing tussen de 12 ml cultuur buis fractiecollector (positie 1) en de 96-well plaat fractiecollector (positie 2), respectievelijk beginnen. Technische noot: Denk aan de 96-well plaat fractie collector wordt bediend offline uit de BioLogic software. Start het programma methode. Direct na het starten van het programma methode van het hardlopen op te starten op het scherm bedieningspaneel van de offline 96-wells plaat fractionen verzamelaar. Als de twee fractie verzamelaars zijn niet 100% synchroon, met de hand vooraf de offline 96-well plaat fractie collector als de andere fractiecollector voorschotten aan de tweede fractie verzamelbuis. Let op de real-time weergave van verwachte run parameters te bevestigen. Tegendruk, geleidbaarheid, en% B (figuur 4) worden uitgevoerd parameters die kunnen worden gecontroleerd aan kolom-to-kolom reproduceerbaarheid van de run te verzekeren. Valve positionering, pH, en sample laden moet ook worden gecontroleerd. UV-traces kan worden vergeleken met soortgelijke doorstroming te controleren elutie pieken. Gebruik in-line en post-run eluaat analysetechnieken voor het elutieprofiel en zuivering van het eiwit van belang (bijvoorbeeld "doeleiwit") te bepalen. Voor monsters met GFP, leven zij de elutie in-line met behulp van het eiwit van de unieke UV-absorptie bij 397 nm. Vergelijk de GFP-specifieke 397 nm absorptie traceren aan de algemene eiwit 280 nm absorptie het opsporen van de relatieve afstand schattenen zuivering met de verschillende HIC media zijn gescout (figuur 5). Post-run analyse van GFP en andere doelgroepen eiwitten kan worden bereikt door meerdere methoden. Aliquots van 5-50 ul van de 96-well plaat fracties worden overgebracht naar een nieuwe plaat en getest op specifieke eiwit met ELISA of western blot en totale eiwitgehalte van elk deel kan worden geanalyseerd met behulp van conventionele SDS-PAGE of Experion microfluïdische elektroforese-systeem. GFP kan worden gedetecteerd in 12 ml kweekbuizen met UV-licht (figuur 6). Identificatie van de meest veelbelovende HIC media kan worden bepaald door vergelijking van GFP elutie opzichte van andere eiwitten die in het monster. Zuivering met de meest veelbelovende HIC media kan dan worden geoptimaliseerd om andere parameters, met inbegrip van type en de concentratie van start buffer en pH. Technische noot: Aan het einde van het experiment, eerst alle inlaat-lijnen in de buffer B1 (ontgastH 2 O) en spoel de pompen, kleppen, en alle leidingen met water. Volg de instructies van de fabrikant voor het reinigen en langdurige opslag van chromatografie-systeem en HIC kolommen. 6. Representatieve resultaten: Vertegenwoordiger HIC zout gradiënt, geleidbaarheid, en kolom druk van de scouting runs zijn weergegeven in figuur 4. De verandering in zoutconcentratie (blauw), zoals gemeten door het percentage buffer getrokken hoge zout buffer lijnen typisch HIC methode. Als de zoutconcentratie afneemt, eiwitten gebonden aan de kolom elueren. Geleidbaarheid (rode lijn), wat overeenkomt met acht zoutconcentratie, wordt in-line gemeten onmiddellijk na de QuadTec en UV-detectoren. De verrekend tussen zoutgradiënt en geleidbaarheid tracings geeft de tijd nodig om van buffer de buffer inlaat door het systeem en de geleiding monitor. In het monster run, thij druk van het systeem (grijze lijnen) en de pH relatief constant blijven. Figuur 5 toont chromatogrammen van sequentiële HIC kolom scouting runs. De in-line detectie van totale eiwit (A 280 blauwe lijn) en GFP (A 397 groene lijn) wordt bereikt door de absorptie van licht bij 280 nm en 397 nm. Het is mogelijk om ongeveer de relatieve abundantie GFP en scheiding van elke scouting run door vergelijking van de twee lijnen. GFP gebonden aan de geteste HIC kolommen met een verschillende mate van affiniteit en haar elutieprofiel gevarieerd. Selectie van een voorkeurs-HIC kolom voor de toekomst zuiveringen is gebaseerd op het identificeren van de kolom die de scherpste GFP elutie piek en de grootste afstand tot andere eiwitten produceert. In figuur 6 kweekbuizen voor fracties 10, 12, 14, 16 en 18 van de Phenyl FF (hoge sub) scouting run werden gevisualiseerd onder omgevingstemperatuur (TL) licht en ultraviolet (UV) licht. Buizen werden bekeken zowel face-forward (links panelen) en top-down (rechter panelen) om de karakteristieke GFP emissiespectrum te observeren. GFP (groen) duidelijk gedetecteerd fractie 14 in beide UV beelden. Deze post-run data mooi overeenkomen met de in-line detectie van GFP door het meten van eluaat absorptie bij 397 nm (A 397, groene lijn), die ook Breuk 14 identificeert als met de grote piek van geëlueerd GFP. De diffuse blauw in het linker paneel is UV-licht dat wordt uitgezonden van de UV-lamp. Figuur 1. Schematische weergave van dit protocol. Bacteriële lysaat met eiwit van belang (GFP, target-eiwit) wordt bereid, verdund in een high-zout buffer gelijk aan de chromatografie start buffer, en gefilterd. Als de vloeistof chromatografie systeem bereid monster geladen en het doeleiwit wordt gescheiden van andere eiwitten die in het lysaat met een hydrofobe chromatografie medium in een voorverpakte HIC kolom. De scheidingsmethode wordt verscheidene malen herhaald met verschillende media chromatografie (hierna kolom scouting) om te bepalen welke media de beste GFP scheiding biedt. De geëlueerde eiwitten (eluaat) wordt geanalyseerd in-line met behulp van detectoren in de chromatografie-systeem en het wordt opgevangen in kleinere fracties voor de volgende (post-run) analyse. Op basis van de in-line en post-termijn analyse van GFP activiteit en scheiding een optimale HIC kolom en chromatografische medium worden geïdentificeerd. Tabel 1. Key chromatografie onderdelen van het systeem wordt gebruikt in dit protocol. Figuur 2. Schema van Bio-Rad DuoFlow het midden-druk vloeistof chromatografie toegepast systeem. Belangrijkste kenmerken van de syhet gevolg zijn onder andere geautomatiseerde buffer blending, het laden van het monster voor opeenvolgende kolom runs, geautomatiseerde selectie van verschillende chromatografiekolommen, in-line analyse van het eluaat, en tandem collectie van het gefractioneerde eluaat. Zie de tekst en tabel 1 voor details. Tabel 2. Biofysische kenmerken van HIC media getest. De naam van de HiTrap HIC kolom indicatief is voor de ligand ligand dichtheid en korrelgrootte. * FF = snelle doorstroming; HP = hoge prestaties. Grotere korrelgrootte verhoogt ligandbinding capaciteit en debiet. Kleinere korrelgrootte verhoogt chromatografische resolutie. Informatie uit de literatuur van de fabrikant. Figuur 3. Aansluiting van GE Healthcare HiTrap HIC kolom aan Bio-Rad DuoFlow system.To de upstream 1/4-28 Delrin moer eennd ring (A1), een mannelijke Luer-naar-vrouw 1/4-28 fitting (B1) en mannelijke 1/16 "-naar-vrouw Luer fitting (C) zijn aangesloten. De fittingen zijn aan de HiTrap kolom hechten nadat hij gespoeld met buffer, met alle bellen verwijderd. de kolomuitlaat is verbonden met een vrouwelijke 1/16 "-mannetje M6 fitting (D), mannelijke Luer te vrouwelijke M6 fitting (E) en vrouwelijke Luer-vrouw een / 4-28 fitting (B 2). Dit geheel wordt verbonden met de stroomafwaartse 1/4-28 Delrin moer ferrule (A 2). Het bovenste paneel toont de inrichting gescheiden en het onderste paneel toont de inrichting gemonteerd. Stap # Volume (ml) Beschrijving Parameters 1 0,00 Verzamel 1,0 ml fracties tijdens de gehele run 2 0,00 Switch Columns HIC kolom 1 (Positie 2) 3 0,00 Isocratische Flow pH: 6,80 100% B Volume: 2,00 mL Flow: 1,00 ml / min 4 2,00 Zero Baseline QuadTec 5 2,00 Zero Baseline UV detector 6 2,00 Injecteer Sample Voorbeeld Load Dynamische Loop Auto Injecteer Valve Volume: 0,50 mL Flow: 1,00 ml / min 7 3,00 Isocratische Flow pH: 6,80 100% B Volume: 5,00 mL Flow: 1,00 ml / min 8 8,00 Lineair verloop pH: 6,80 100% B -> 0% B Volume: 10,00 mL Flow: 1,00 mL/ Min 9 18,00 Isocratische Flow pH: 6,80 0% B Volume: 3,00 mL Flow: 1,00 ml / min 10 21,00 Isocratische Flow pH: 6,80 100% B Volume: 5,00 mL Flow: 1,00 ml / min 11 26,00 Switch Columns Unie (Positie 1) Einde 26,00 Einde van het Protocol Automatisch herhalingen met 5 extra HIC kolommen (Posities 3-7) Scout soort Aantal Runs: 6 Aantal stappen gescout: 1 Tabel 3. BioLogic software protocol voor het HIC in dienst scouting methode. <img alt = "Figuur 4" src = "/ files/ftp_upload/3060/3060fig4.jpg" /> Figuur 4. Vertegenwoordiger HIC zout gradiënt, geleidbaarheid, en kolom druk. Als de zoutconcentratie (blauwe lijn) afneemt, geleidbaarheid (rode lijn) doet ook. De off-set tussen zout gradiënt en geleidbaarheid Tracings geeft de tijd die nodig is voor buffer om van de buffer inlaat naar de geleidbaarheid monitor. Systeem druk (grijze lijnen) blijft relatief constant voor de duur van de scouting run. Figuur 5. Samengesteld chromatogrammen van sequentiële HiTrap HIC kolom scouting runs. De in-line detectie van totale eiwit (A 280 blauwe lijn) en GFP (A 397 groene lijn) wordt bereikt door de absorptie van licht bij 280 nm en 397 nm. In deze serie proeven werd de sterkste GFP elutie waargenomen piek met fenyl FF (hoge sub) column. De fenyl FF (hoge sub) kolom ook bleek de grootste afstand tussen GFP en andere eiwitten produceren. Extra 1 ml HiTrap HIC kolommen getest opgenomen Phenyl snelle doorstroming lage substitutie (Phenyl FF (lage sub)), butyl fast flow (butyl FF), butyl-S fast flow (butyl-S FF), en octyl snelle flow (octyl FF) . Figuur 6. Vertegenwoordiger van Post-Run visualisatie van GFP in de steekproef eluaat. Eluaat fracties werden verzameld met een snelheid van 1/minuut en elk werd geanalyseerd voor GFP inhoud. In dit representatieve waarde, cultuur buizen voor Breuken 10, 12, 14, 16, en 18 van het Phenyl FF (hoge sub) scouting run werden zichtbaar onder omgevingstemperatuur (TL) licht en ultraviolet (UV) licht. Buizen werden bekeken zowel face-forward (links panelen) en top-down (rechts panelen). De diffuse blauw in het linker paneel is UV-licht dat wordt uitgezonden van de UV-lamp. GFP (groen) duidelijk gedetecteerd FracTION 14 in beide UV beelden. Het bovenste paneel geeft de totale hoeveelheid eiwit (A280, blauwe lijn) en GFP (A 397, groene lijn) chromatogram traces van de 5 fracties gevisualiseerd wordt.