Fundición cerebrovascular del ratón adulto de imágenes en 3D y el análisis morfológico

1. Limpieza de sangre de la vasculatura Anestesiar a ratones mediante la inyección intraperitoneal de 100 mg / kg de ketamina con 10 mg / kg de xilazina diluida en solución salina 0,25 ml. Una vez que la anestesia ha sido confirmado por no responder a una pizca de la pata, utilizar tijeras para hacer una incisión en el pecho con unas tijeras justo debajo de la apófisis xifoides, corte a través del diafragma, y ​​cortada entre el segmento dorsal y ventral de la caja torácica para exponer la cavidad torácica. Exponer el corazón doblando el esternón y la pared torácica adyacente y seguro con pinzas hemostáticas. Abrir el saco pericárdico con pinzas para exponer el corazón. Encienda la bomba de perfusión (100 mmHg de presión) conectado a PBS caliente más heparina (5 unidades / ml) en un baño de agua caliente a 37 ° C y el tubo con una aguja de calibre 22 en la contundente salida. Insertar la aguja en el ventrículo izquierdo, cerca del ápice del corazón. Inmediatamente abrieron la aurícula derecha para permitir flujo arterial sistémica y continuar el lavado hasta la sangre is retiró de la circulación. 2. La perfusión de agente de casting en el sistema vascular Prepare Microfil (Flow Tech, Inc. Carver, MA) solución de fundición por el protocolo del fabricante: Mezclar 5 ml de diluyente MV con 4 ml de compuesto MV filtrado. Agregar 450μl (5%) de catalizador (MV agente de curado). Tiempo de solución de trabajo es de 20 minutos, pero la mezcla inmediatamente antes de su uso para asegurar la viscosidad adecuada. Retirar de fundición solución del agente en una jeringa de 10 ml, adjuntar un contundente 20 aguja a la jeringa y la aguja de llenado con la solución. Insertar la aguja en el ventrículo izquierdo a través del mismo agujero utilizado para la irrigación de la sangre. Aguja asegura en su lugar con la pinza hemostática en el corazón. Inyectar la solución de fundición agente lentamente hacia el ventrículo izquierdo a aproximadamente 3 ml / min. El exceso de presión puede conducir a un flujo incorrecto de agente de casting o de ruptura de los vasos potencial. Busque signos de perfusión con éxito, incluyendo: Visualización del repartoción del agente en la vasculatura intestino y el hígado, decoloración de la extremidad distal, y la nariz y la decoloración de la lengua. Reajustar la aguja, si es necesario para lograr una perfusión adecuada. 3. Recolección y procesamiento de tejidos Quitar el cerebro y el lugar en paraformaldehído al 4% durante la noche a 4 ° C. Deshidratar el cerebro mediante la colocación de paraformaldehído directamente en EtOH concentra cada vez más a temperatura ambiente: 25% EtOH, 1 día, 50% de EtOH, 1 día, 75% de EtOH, un día, y el 95% de EtOH, 2 días, y el 100% EtOH, 2 días . Aclarar el tejido cerebral alrededor de los vasos sanguíneos del cerebro mediante la inmersión de perfusión en salicilato de metilo durante 2 días a temperatura ambiente. Vasos sanguíneos de todo el cerebro unsectioned aclarado se pueden visualizar con el cerebro inmerso en salicilato de metilo bajo un microscopio de disección (Fig. 1) (Leica MZFL microscopio III, Leica Microsystems, Bannockburn, IL) o microscopio de campo claro (Fig. 2) (Leica DM / LS, Leica Microsystems). Reclarificationse puede hacer si el tejido no esté completamente curada. Del cerebro de la transferencia de salicilato de metilo, el 95% de EtOH durante 2 días, 100% EtOH durante 2 días, y salicilato de metilo durante 2 días. 4. Micro-TC o la preparación histológica de aplicación de tejidos El cerebro se pueden visualizar mediante micro-CT directamente después de la aclaración o después de la re-hidratación (Fig. 4). Para preparar el tejido cerebral para el análisis histológico, rehidratar el cerebro a través de EtOH diluida en serie: EtOH al 100%, un día, y el 95% de EtOH, 1 día, 75% de EtOH, 1 día, 50% de EtOH, 2 días, 25% de EtOH, 2 días y almacenar en PBS. El cerebro entonces puede ser embebido en parafina utilizando un procedimiento estándar. 5. Resultados representante Después de fundición vascular, la cerebrovasculature se puede ver macroscópicamente en la superficie del cerebro (Fig. 1A). Del árbol vascular en el interior del parénquima se puede visualizar la siguiente aclaración (Fig. 1B). La estructura vascular detalladapueden ser reflejados y analizados bajo un microscopio de campo claro (Fig. 2), la disección de alcance (Fig. 3), y con micro-TC (Fig. 4). Mediante microscopía de campo claro, los vasos se pueden ver en diferentes planos focales sin seccionar el cerebro (Fig. 2A), así como microvasos individuales a mayores aumentos (Fig. 2B). Bajo un microscopio de disección, se puede ver toda la estructura vascular en un plano focal, lo que permite una mejor visualización de la estructura tridimensional de la cerebrovasculature (Fig. 3). Las imágenes tomadas con un microscopio de disección puede mostrar la morfología de los vasos grandes y vasos de todo el cerebro, pero carecen de los datos que aparecen en las imágenes tomadas con el microscopio de campo claro (Fig. 2B). Esta técnica nos ha permitido detectar embarcaciones irregulares en nuestro modelo de ratón experimental BAVM adulto 2. La Figura 5 muestra un ejemplo de las mismas embarcaciones irregulares detectados por micro-TC (Fig. 5) y el microscopio de campo claro (Fig. 5B). En conjunto, estos datos muestran que se puede analizar tque muestra lo mismo con las herramientas de imágenes múltiples después de la fundición vascular. Figura 1. Cerebro de ratón toda la nueva fundición vascular. Antes (A) y después (B) la clarificación salicilato de metilo solvente. Los buques pueden ser claramente visualizado en la superficie del cerebro (A) y en el procedimiento de parénquima siguiente aclaración (B). Figura 2. Microscopio de campo claro imágenes aclaró cerebro vascular fundido. El cerebro se pueden obtener imágenes en diferentes planos y en diferentes niveles de ampliación. Barra de escala 200μm (A) y 50 micras (B). Figura 3. Disección de imagen microscópica muestra a 1x ratón adulto cerebrovasculature todo el cerebro de una vista dorsal. <img alt = "Figura 4" src = "/ files/ftp_upload/2958/2958fig4.jpg" /> Figura 4. Micro-TC imagen de la misma de todo el cerebro del ratón adulto se muestra en la Figura 3 a partir de una vista dorsal. Figura 5. Aplicación del método de fundición vascular para detectar una malformación arteriovenosa cerebral. A) Micro-TAC de cerebro vascular fundido muestra ampliada de la región, irregular AVM-como los vasos en el hemisferio derecho de una vista ventral. Imagen ampliada de la región (caja blanca) se muestra a la derecha. B) Lo mismo que los vasos irregulares visualizaron bajo microscopio de campo claro con un aumento de 50x. Barra de escala 50 micras.