3D 이미징 및 형태학의 분석을위한 성인 마우스 뇌혈관 캐스팅

1. Vasculature에서 혈액을 지우기 0.25 ML의 식염수에 희석 10 밀리그램 / kg xylazine 100 밀리그램 / kg 300ml의 intraperitoneal 주사하여 마우스를 마취. 마취가 발자국 꼬집어없이 반응에 의해 확인되면 다이어프램 쪽을 통과해서 바로 xyphoid 과정을 아래에 가위와 가슴팍 절개를 만들기 위해 가위를 사용하여 흉강을 폭로 ribcage의 지느러미와 복부 세그먼트 사이 했네요. 흉골과 인접 가슴 벽을 접는하고 hemostat과 보안에 의해 마음을 쉽게받을 수 있습니다. 마음을 노출 핀셋으로 pericardial SAC를 엽니다. PBS 플러스 헤파린 (5 단위 / ML) 37시 온수 욕조에서 솔루션 ° C 및 유출에 뭉툭한 22 게이지 바늘로 튜브.을 따뜻하게 연결 살수 펌프 (압력을 100mmHg)를 켜십시오 심장의 꼭대기 근처 좌심실에 바늘을 삽입합니다. 즉시 전신 혈액 유출을 활성화 권리 아트리움을 열고 잘라 피를까지 내가 계속 홍조s의 순환에서 제거. 2. 혈관 계통에 캐스팅 에이전트의 재관류 믹스 필터링 MV 화합물 4 ML과 함께 뮤직 비디오 희석제 5 ML : Microfil (흐름 테크 주식 회사 카버, MA) 제조 업체의 절차에 따라 주조 솔루션을 준비합니다. 촉매의 450μl를 (5 %) (MV 양생 에이전트) 추가합니다. 솔루션 작동 시간은 20 분,하지만 적절한 점도를 보장하기 위해 사용하기 전에 바로 섞는다. 10ml의 주사기에 에이전트 솔루션을 주조 철회, 주사기에 뭉툭한 20 게이지 바늘을 첨부하고 솔루션 바늘을 입력합니다. 혈액을 꼴이지에 사용된 것과 같은 구멍을 통해 좌심실에 바늘을 삽입합니다. 심장에 hemostat 클램프와 장소에 보안 바늘. 약 3 ML / 분 천천히 좌심실로 캐스팅 에이전트 솔루션을 주사. 초과 압력 주조 대리인 또는 잠재적인 선박 파열의 잘못된 흐름으로 이어질 수 있습니다. 를 포함하여 성공적인 재관류의 흔적에 대한 봐요 : 주조의 시각화대장 및 간 vasculature, 말초 사지 변색, 그리고 코, 혀 변색의 ING 에이전트. 필요한 적절한 재관류를 달성하는 경우에는 주사를 정리하다. 3. 수집 및 조직의 처리 4 박 4 % paraformaldehyde에 두뇌 및 장소를 제거 ° C. 직접 상온에서 점점 더 집중 EtOH로 paraformaldehyde의 배치에 의해 머리를 탈수 : 25 % EtOH, 일일, 50% EtOH, 일일, 75% EtOH, 일일, 95% EtOH 2 일, 100 % EtOH 2 일 . 상온에서 2 일간 메틸 살리실산의 perfused 머리를 immersing하여 혈관 주위 뇌 조직을 명확히하십시오. 전체 unsectioned 명확히 두뇌의 Vasculature은 해부 현미경 (그림 1) (Leica MZFL III 현미경, Leica 마이크로 시스템즈, Bannockburn, IL) 또는 brightfield 현미경 (그림 2) (Leica DM / 아래 메틸 살리실산에 포장되어 두뇌와 몇 군데 수 있습니다 LS, Leica 마이크로 시스템즈). Reclarification조직이 완전히 지워되지 않은 경우 수행할 수 있습니다. 메틸 살리실산, 전송 두뇌에서 2 일간 95 % EtOH로, 100 2 일간 %의 EtOH, 2 일간 메틸 살리실산. 4. 마이크로 – CT 영상이나 Histological 응용 조직 준비 두뇌는 바로 (그림 4) 설명 후 또는 다시 수화 이후 마이크로 – CT를 사용하여 몇 군데하실 수 있습니다. ; 95% EtOH, 일일, 75% EtOH, 일일, 50% EtOH 2 일, 25% EtOH 2 일 백퍼센트 EtOH, 1 일 : histological 분석을위한 뇌 조직을 준비하려면, 직렬 희석 EtOH를 통해 머리를 rehydrate , PBS 및 저장합니다. 두뇌는 다음 표준 절차를 사용하여 파라핀에 박혀 수 있습니다. 5. 대표 결과 혈관 캐스팅 후, cerebrovasculature은 뇌의 표면 (Fig.1A)에 macroscopically 볼 수 있습니다. 실질 내부 혈관 트리 (그림 1B를) 다음과 같은 시각 해명하실 수 있습니다. 자세한 혈관 구조몇 군데와 (그림 3) 범위를 해부하고, 마이크로 – CT 스캔 (그림 4), brightfield 현미경 (그림 2)에 따라 분석하실 수 있습니다. brightfield 현미경 사용 vasculature는 높은 배율 (그림 2B)에서 두뇌 (그림 2A)뿐만 아니라 개인 microvessels을 sectioning하지 않고 서로 다른 초점 비행기에서 볼 수 있습니다. 해부 현미경, 하나는 cerebrovasculature의 입체 구조 (그림 3) 더 나은 시각화를 허용 하나의 초점 비행기에서 전체 혈관 구조를 볼 수 있습니다. 해부 현미경으로 촬영한 이미지는 대형 선박 형태 및 전체 뇌 vasculature을 보여주지만, brightfield 현미경 (그림 2B)로 찍은 사진에 표시된 내용을 부족 수 있습니다. 이 기술은 우리가 실험 BAVM 성인 마우스 모델 2 불규칙 혈관을 감지할 수있었습니다. 그림 5는 마이크로 – CT 스캔 (그림의 5A)와 brightfield 현미경 (그림의 5B)에 의해 감지 같은 불규칙한 혈​​관의 예를 보여줍니다. 함께,이 데이터는 우리가 t을 분석할 수 있습니다 것을 보여줍니다혈관 캐스팅 후 여러 이미징 도구를 사용하여 그 같은 샘플. 그림 1. 혈관 캐스트 다음 전체 마우스 뇌. 전 (A)와 용매 메틸 살리실산에 의해 (B) 허가 이후에. 선박은 뇌의 표면 (A)와 실질 다음과 같은 설명 절차 (B)로 명확하게 시각하실 수 있습니다. 명확히 혈관 casted 두뇌의 그림 2. Brightfield 현미경 이미지. 브레인 다양한 비행기에서 서로 다른 배율 수준에서 몇 군데하실 수 있습니다. 스케일 바 200μm (A) 및 50μm (B). 그림 3. 지느러미보기에서 전체 성인 마우스 뇌 cerebrovasculature를 보여주는 1X에서 현미경 이미지를 분석 해 봅시다. <IMG 고도 = "그림 4"SRC = "/ files/ftp_upload/2958/2958fig4.jpg"/> 그림 4. 마이크로 – CT는 지느러미보기에서 그림 3에 표시된 동일한 전체 성인 마우스 두뇌의 이미지를 스캔. 그림 5. 두뇌 arteriovenous보기 흉한 것을 감지 혈관 주조 방법의 응용 프로그램. A) 혈관 casted 두뇌의 마이크로 CT 촬영은 복부보기에서 오른쪽 반구의 확대, 불규칙 AVM 같은 선박의 영역을 보여줍니다. 지역의 확대 이미지 (화이트 박스)은 오른쪽에 표시됩니다. B) 같은 불규칙한 혈​​관는 50x 배율에서 brightfield 현미경 아래에서 시각. 스케일 바 50 μm의.