Zerebrovaskuläre Casting der erwachsenen Maus für 3D-Imaging und morphologische Analyse

1. Clearing Blut aus Gefäßsystem Anesthetize Maus durch intraperitoneale Injektion von 100 mg / kg Ketamin mit 10 mg / kg Xylazin in 0,25 ml Kochsalzlösung verdünnt. Nach Betäubung durch keine Reaktion auf eine Pfote Prise bestätigt worden, mit einer Schere einen Schnitt quer über die Brust zu machen mit einer Schere knapp unter dem Schwertfortsatz, durch die Membran geschnitten, und zerschnitten zwischen dorsalen und ventralen Segment der Brustkorb zu Brusthöhle aussetzen. Expose Herzen durch Hochklappen Brustbeins und der angrenzenden Brustwand und sicher mit hemostat. Öffnen Sie den Herzbeutel mit einer Pinzette in das Herz freizulegen. Schalten Sie Perfusionspumpe (100 mmHg Druck), verbunden mit PBS plus Heparin (5 Einheiten / ml)-Lösung in heißen Wasserbad bei 37 ° C und Schläuche mit einem stumpfen 22-Gauge-Nadel auf den Abfluss. Warmer Führen Sie die Nadel in die linke Herzkammer, in der Nähe der Herzspitze. Unmittelbar schnitt den rechten Vorhof zur systemischen Blut Abfluss zu ermöglichen und spülen, bis das Blut is aus dem Verkehr gezogen. 2. Perfusion von Casting-Agenten in das Gefäßsystem Bereiten Microfil (Flow Tech, Inc. Carver, MA) Gießlösung pro Protokoll des Herstellers: Mix 5 ml MV Verdünnungsmittel mit 4 ml des gefilterten MV-Verbindung. Fügen Sie 450μl (5%) des Katalysators (MV Härter). Lösung Arbeitszeit beträgt 20 Minuten, sondern mischen unmittelbar vor der Anwendung die richtige Viskosität gewährleisten. Ziehen Casting-Agent-Lösung in eine 10ml Spritze, legen einen stumpfen 20-Gauge-Nadel auf die Spritze und füllen Nadel mit Lösung. Setzen Sie die Nadel in die linke Herzkammer durch das gleiche Loch für die Spülung des Blutes eingesetzt. Sichere Nadel in Stelle mit hemostat Klemme am Herzen. Inject Casting-Agent-Lösung langsam in den linken Ventrikel bei ca. 3 ml / min. Überdruck kann zu falschen Fluss der Casting-Agenten oder potentielle Schiff Bruch führen. Achten Sie auf Anzeichen für eine erfolgreiche Perfusion, darunter: Visualisierung von castIng.-Agent in Darm und Leber Gefäßsystem, distalen Gliedmaßen Verfärbung und Nase und Zunge verfärbt. Nachstellen Nadel ggf. richtige Durchblutung zu erreichen. 3. Erhebung und Verarbeitung von Tissue Entfernen Gehirn und in 4% Paraformaldehyd über Nacht bei 4 ° C. Entwässern des Gehirns, indem sie aus Paraformaldehyd direkt in zunehmendem Maße konzentriert EtOH bei Raumtemperatur: 25% EtOH, 1 Tag, 50% EtOH, 1 Tag, 75% EtOH, 1 Tag, 95% EtOH, 2 Tage, und 100% EtOH, 2 Tage . Klären Hirngewebe um die Blutgefäße durch Eintauchen der perfundierten Gehirn in Methylsalicylat für 2 Tage bei Raumtemperatur. Gefäßsystem des gesamten ungeschnittenen geklärt Gehirn mit Gehirn in Methylsalicylat unter einem Binokular (Abb. 1) (Leica MZFL III Mikroskop Leica Microsystems, Bannockburn, IL) oder Hellfeld-Mikroskop (Abb. 2) (Leica DM / eingetaucht abgebildet werden LS, Leica Microsystems). Reclarificationkann getan werden, wenn Gewebe ist nicht vollständig geklärt werden. Von Methylsalicylat, Transfer Gehirn zu 95% EtOH für 2 Tage, 100% EtOH für 2 Tage, und Methylsalicylat für 2 Tage. 4. Micro-CT-Bildgebung oder histologische Application-Tissue Vorbereitung Das Gehirn kann abgebildet mit Mikro-CT unmittelbar nach Klärung oder nach Rehydrierung (Abb. 4). Zur Vorbereitung Hirngewebe für die histologische Analyse, rehydrieren das Gehirn durch serielle Verdünnung EtOH: 100% EtOH, 1 Tag, 95% EtOH, 1 Tag, 75% EtOH, 1 Tag, 50% EtOH, 2 Tage, 25% EtOH, 2 Tage , und speichern in PBS. Das Gehirn kann dann in Paraffin mit einem Standard-Verfahren eingebettet werden. 5. Repräsentative Ergebnisse Nach Kreislauf-Casting, können die cerebrovasculature makroskopisch an der Hirnoberfläche (Abb. 1a) zu sehen. Die Gefäßbaumes im Parenchym visualisiert folgende Klarstellung werden (Abb. 1B). Die detaillierten Gefäßstrukturkönnen abgebildet und analysiert werden unter einem Mikroskop Hellfeld (Abb. 2), Binokular (Abb. 3), und mit Mikro-CT-Scan (Abb. 4). Mit Hellfeldmikroskopie, können die Gefäße in verschiedenen Fokusebenen ohne Schneiden des Gehirns (Abb. 2A) sowie individuelle Mikrogefäßen bei höherer Vergrößerung (Abb. 2B) eingesehen werden. Unter einem Binokular, kann man das gesamte vaskuläre Struktur in einer Brennebene zu sehen, die eine bessere Visualisierung der dreidimensionalen Struktur des cerebrovasculature (Abb. 3). Bilder unter einem Binokular genommen werden zeigen großes Schiff Morphologie und ganze Gehirn Gefäßsystem, aber nicht über die Details in Bildern mit Hellfeld-Mikroskopie (Abb. 2B) übernommen gezeigt. Diese Technik hat uns erlaubt, unregelmäßige Schiffe in unserer experimentellen BAVM erwachsenen Maus-Modell 2 zu erfassen. Abbildung 5 zeigt ein Beispiel aus dem gleichen unregelmäßige Gefäße durch Mikro-CT-Scan (Abb. 5A) und Hellfeld (Abb. 5B) erkannt. Gemeinsam, zeigt diese Daten, können wir t analysierener dieselbe Probe mit mehreren bildgebenden Verfahren nach vaskulären Gießen. Abbildung 1. Whole Gehirn der Maus nach einer Gefäßverletzung Gießen. Vor (A) und nach (B) Klärung durch Methylsalicylat Lösungsmittel. Schiffe werden übersichtlich visualisiert auf der Hirnoberfläche (A) und in Parenchym folgende Klarstellung Verfahren (B). Abbildung 2. Hellfeld-Mikroskop Bilder von geklärt vaskulären gegossen Gehirn. Gehirn kann auf verschiedenen Ebenen und in verschiedenen Vergrößerungen abgebildet werden. Maßstabsbalken 200 um (A) und 50 um (B). Abbildung 3. Präpariermikroskop Bild mit 1x zeigen gesamten erwachsenen Gehirn der Maus cerebrovasculature aus einer Dorsalansicht. <img alt = "Bild 4" src = "/ files/ftp_upload/2958/2958fig4.jpg" /> Abbildung 4. Micro-CT-Scan-Bild der gleichen gesamten erwachsenen Gehirn der Maus in Abbildung 3 aus einer dorsalen Ansicht dargestellt. Abbildung 5. Einsatz von vaskulären Gießverfahren ein Gehirn arteriovenöse Missbildung zu erkennen. A) Micro-CT-Scan der vaskulären gegossen Gehirn zeigt Region vergrößert, unregelmäßig AVM-wie Schiffe in der rechten Hemisphäre von einer Ventralansicht. Größeres Bild der Region (white box) ist auf der rechten Seite angezeigt. B) Gleiche unregelmäßige Gefäße sichtbar unter Hellfeld-Mikroskop bei 50facher Vergrößerung. Maßstabsleiste 50 um.