3D Görüntüleme ve Morfolojik Analizi Yetişkin Mouse Serebrovasküler Döküm

1. Kan damarları gelen Takas Fare 0.25 ml serum fizyolojik içinde sulandırılmış 10 mg / kg xylazine ile 100 mg / kg ketamin intraperitoneal anestezisi. Anestezi pençe tutam hiçbir yanıt tarafından onaylandıktan sonra, diyafram üzerinden kesilmiş, sadece xiphoid işlemi aşağıda makas, göğsünde bir kesi yapmak için makas kullanmak ve dorsal ve ventral segment, göğüs boşluğu maruz ile göğüs kafesi arasında kesmek. Sternum ve komşu göğüs duvarı, katlama ve hemostat ile güvenli kalp Açığa. Perikard kesesi, kalp açığa çıkarmak için cımbız ile açın. PBS artı heparin (5 adet / ml) sıcak su banyosu çözüm 37 ° C ve çıkışı künt 22 gauge iğne ile tüp sıcak bağlı perfüzyon pompası (basınç 100mmHg) açın Kalbin apekse yakın, sol ventrikül içine iğne takın. Sistemik kan çıkışı hemen etkinleştirmek için sağ atrium ve açık kesmek kadar kan i yıkamaya devam edindolaşımdan kaldırılmış. 2. Damar Sistemi içine Döküm Agent Perfüzyon Mix süzülmüş MV bileşik 4 ml ile 5 ml OG seyreltici: Microfil (Akış Tech, Inc Carver, MA) üreticinin protokol başına döküm çözüm hazırlayın. Katalizör 450μl (% 5) (OG sertleştirici) ekleyin. Çözüm çalışma süresi 20 dakikadır, ancak uygun viskozite sağlamak için kullanmadan önce hemen karıştırın. 10ml şırınga içine ajan çözüm döküm Çekme 20 künt bir iğne, şırınga takın ve çözümü ile iğne doldurun. Sol ventrikül içine kan kızarma için kullanılan aynı delikten iğne takın. Güvenli iğne kalp hemostat kelepçe yerleştirin. Döküm ajan çözümü yaklaşık 3 ml / dk yavaş yavaş sol ventrikül içine enjekte edilir. Aşırı basınç döküm ajan veya potansiyel damar rüptürü yanlış akışına neden olabilir. Dahil olmak üzere başarılı bir perfüzyon belirtilerini arayın: döküm görselleştirilmesibağırsak ve karaciğer damarsal, distal ekstremite renk değişikliği, ve burun ve dilde renk değişikliği ing ajan. Gerekli uygun perfüzyon ulaşmak için iğne yeniden ayarlayın. 3. Doku Toplama ve İşleme % 4 paraformaldehid beyin ve yer çıkarın gece 4 ° C % 25 EtOH, 1 gün,% 50 EtOH, 1 gün,% 75 EtOH, 1 gün,% 95 EtOH, 2 gün ve% 100 EtOH, 2 gün oda sıcaklığında giderek konsantre EtOH içine doğrudan paraformaldehid koyarak beyin dehydrate: . 2 gün boyunca oda sıcaklığında metil salisilat perfüze beyin çeker, kan damarlarının çevresindeki beyin dokusu netleştirin. Bütün unsectioned açıklık beyin damarları, beyin, diseksiyon mikroskobu (Şekil 1) (Leica MZFL III mikroskop, Leica Microsystems, Bannockburn, IL) veya aydınlık alan mikroskobu (Şekil 2) (Leica DM / altında metil salisilat içine ile görüntülenmiş olabilir LS, Leica Microsystems). Reclarificationdoku tamamen temizlenir değilse yapılabilir. Metil salisilat, transfer beyin itibaren 2 gün boyunca% 95 EtOH, 2 gün boyunca% 100 EtOH ve 2 gün boyunca metil salisilat. 4. Micro-CT Görüntüleme veya histolojik Uygulama Doku Hazırlama Beyin doğrudan (Şekil 4) açıklama sonra veya yeniden hidrasyon sonra mikro-BT ile görüntülenebilir. Beyin dokusu histolojik analiz için hazırlamak için, seri seyreltilmiş EtOH ile beyin rehidrate% 95 EtOH, 1 gün;% 75 EtOH, 1 gün,% 50 EtOH, 2 gün,% 25 EtOH, 2 gün% 100 EtOH, 1 gün: PBS içinde saklayın. Beyin, daha sonra standart bir prosedür kullanılarak parafine gömülü olabilir. 5. Temsilcisi Sonuçlar Vasküler döküm cerebrovasculature makroskobik beyin yüzeyi (Fig.1A) görülebilir. Parankim içinde damar ağacı (Şekil 1B) görüntülenmiştir aşağıdaki açıklama olabilir. Detaylı bir damar yapısıgörüntülü ve kapsamı diseksiyon (Şekil 3) ve mikro-BT (Şekil 4), bir aydınlık alan mikroskobu (Şekil 2) altında analiz edilebilir. Aydınlık alan mikroskobu kullanarak, damar, yüksek büyütme (Şekil 2B) (Şekil 2A) beynin yanı sıra bireysel mikrodamarlar kesit farklı odak uçakları görülebilir. Diseksiyon kapsamında, bir cerebrovasculature üç boyutlu yapısı (Şekil 3) daha iyi görselleştirme izin, tek bir odak düzlemli tüm vasküler yapı görebilirsiniz. Büyük damar morfolojisi ve tüm beynin damarsal bir diseksiyon mikroskobu altında çekilen görüntüler gösterir, ancak aydınlık alan mikroskobu (Şekil 2B) ile çekilen fotoğrafları gösterilen detayları eksikliği olabilir. Bu teknik bize deneysel BAVM yetişkin fare modelinde 2 düzensiz damarları tespit etmek için izin verdi. Şekil 5 mikro-BT (Şekil 5A) ve aydınlık alan mikroskobu (Şekil 5B) tarafından tespit edilen aynı düzensiz damarlarının bir örnek gösterir. Hep birlikte, bu veriler t analiz olduğunu gösterirvasküler attıktan sonra çoklu görüntüleme araçları ile aynı örnek. Şekil 1. Tüm fare beyin damar döküm. Önce (A) ve (B) solvent metil salisilat açıklama sonra. Gemileri beyin yüzeyinin (A) ve parankim aşağıdaki açıklama prosedürü (B) açıkça görüntülenmiştir. Şekil 2 açıklık vasküler döküm beyin aydınlık mikroskop görüntüleri. Beyin, çeşitli uçaklar ve farklı büyütme seviyelerinde görüntülü olabilir. Ölçek Bar 200μm (A) ve (B) 50μm. Şekil 3 dorsal görünümü gösteren tüm yetişkin fare beyin cerebrovasculature 1x mikroskopta görüntü Diseksiyon. <img alt = "Şekil 4" src = "/ files/ftp_upload/2958/2958fig4.jpg" /> Şekil 4 Micro-CT dorsal görünümü Şekil 3'te gösterilen tüm yetişkin fare beyin tarama görüntü. Şekil 5 beyin arteriovenöz malformasyon tespit etmek için vasküler döküm yöntemi uygulanması. A) beyin damar döküm Micro-CT taraması ventral bir görünümden sağ hemisfer genişletilmiş, düzensiz AVM gibi gemiler bölge gösterir. Bölge büyütülmüş görüntü (beyaz kutu), sağ tarafta gösterilmiştir. B) Aynı düzensiz damarlar 50x büyütme aydınlık mikroskop altında görüntülendi. Ölçek çubuğu 50 mm.