Цереброваскулярные Литье взрослых мышь для 3D-визуализации и морфологический анализ

1. Очистка крови с сосудистой Анестезию мыши, при введении препарата в дозе 100 мг / кг кетамина с 10 мг / кг ксилазина разводят в 0,25 мл физиологического раствора. После анестезии было подтверждено отсутствие ответа на лапу крайнем случае, используйте ножницы, чтобы сделать разрез на груди с помощью ножниц чуть ниже xyphoid процесса, прорезать диафрагмы и разрезать между спинной и брюшной части грудной клетки, чтобы разоблачить грудной полости. Expose сердце, складывая грудины и смежных грудной стенки и закрепите кровоостанавливающего. Открытое перикард с помощью пинцета, чтобы разоблачить сердце. Включите перфузионного насоса (100mmHg давление), подключенных к теплым PBS плюс гепарин (5 ед / мл) раствор в ванну с горячей водой при температуре 37 ° С, а трубка с тупой иглой 22 калибра на отток. Вставьте иглу в левый желудочек, у верхушки сердца. Сразу же разрезать правое предсердие включить системный отток крови и продолжайте промывку до крови яс изъяты из оборота. 2. Перфузии агент по кастингу в сосудистой системы Подготовка Microfil (Flow Tech, Inc Карвер, MA) литье решение в соответствии с протоколом производителя: смешать 5 мл растворителя М. В. с 4 мл фильтрованного М. В. соединения. Добавить 450μl (5%) катализатора (М. В. отвердителя). Решение рабочего времени составляет 20 минут, но смешивать непосредственно перед применением, чтобы обеспечить надлежащую вязкость. Вывод агент по кастингу раствора в 10 мл шприц, приложите тупой иглой 20 калибра, чтобы шприц и иглу заполнить раствором. Вставьте иглу в левый желудочек через те же отверстия используются для промывки крови. Безопасные иглу в место с кровоостанавливающего зажима на сердце. Inject решение агент по кастингу медленно в левом желудочке примерно в 3 мл / мин. Избыточное давление может привести к неправильным потоком агент по кастингу или потенциального разрыва сосуда. Ищите признаки успешного перфузии, в том числе: визуализация литойING агента в кишечнике и печени, сосудистой, дистальный обесцвечивание конечностей, а нос и язык цвета. Отрегулируйте иглы при необходимости для достижения надлежащего перфузии. 3. Сбор и обработка тканей Удалить мозга и место в 4% параформальдегида ночи при 4 ° C. Дегидрировать мозга путем размещения от параформальдегида прямо в большей степени концентрируется этанола при комнатной температуре: 25% этанола, 1 день, 50% этанола, 1 день, 75% этанола, 1 день, 95% этанола, 2 дней, и 100% этанолом, 2 дня . Уточнить мозговой ткани вокруг кровеносных сосудов путем погружения перфузии мозга в метилсалицилат в течение 2 дней при комнатной температуре. Сосудистую всего unsectioned уточнил мозг может быть, полученную с использованием мозга погружены в метилсалицилат при вскрытии микроскопа (рис. 1) (Leica MZFL III микроскоп, Leica Microsystems, Bannockburn, IL) или светлое микроскопа (рис. 2) (Leica DM / LS, Leica Microsystems). Reclarificationможно сделать, если ткани не полностью очищен. С метилсалицилат, передача мозга до 95% этанола в течение 2 дней, 100% этанола в течение 2 дней, и метилсалицилат на 2 дня. 4. Микро-КТ или Гистологическое приложений подготовки ткани Мозг может быть отображены с использованием микро-КТ непосредственно после разъяснений или после повторной гидратации (рис. 4). Для подготовки мозговой ткани для гистологического анализа, увлажняет мозг через последовательный разбавленного этанола: 100% этанола, 1 день, 95% этанола, 1 день, 75% этанола, 1 день, 50% этанола, 2 дня, 25% этанола, 2 дня ; и хранить в PBS. Мозг может быть в парафин использованием стандартной процедурой. 5. Представитель Результаты После сосудистых литье, cerebrovasculature видно макроскопически на поверхности мозга (рис. 1а). Сосудистого дерева внутри паренхимы могут быть визуализированы следующее разъяснение (рис. 1б). Подробное сосудистой структурымогут быть отображены и проанализированы под микроскопом светлое (рис. 2), рассекая область (рис. 3), а с микро-КТ (рис. 4). Использование светлого микроскопии, сосудистую можно рассматривать в разных фокальных плоскостях без срезов головного мозга (рис. 2), а также отдельных микрососудов при большем увеличении (рис. 2В). Под рассекает сферу, можно увидеть весь сосудистые структуры в одной фокальной плоскости, что позволяет лучше визуализировать трехмерные структуры cerebrovasculature (рис. 3). Изображения, полученные при вскрытии микроскоп может показать большие морфологии судно и весь сосудистой мозга, но отсутствие подробностей показано на фотографии, полученной с светлого микроскопии (рис. 2В). Этот метод позволил нам обнаружить нерегулярные судов в наших экспериментальных BAVM взрослых мышах 2. Рисунок 5 показывает пример того же нерегулярные судов обнаружены микро-КТ (рис. 5а) и светлое микроскопа (рис. 5б). Вместе, эти данные показывают, что мы можем проанализировать тон же образца с несколькими инструментами визуализации после сосудистой литья. Рисунок 1. Весь мозг мыши следующий сосудистой литья. До () и после (б) разъяснение метилсалицилат растворителя. Суда могут быть четко визуализируется на поверхности мозга (А) и в паренхиме следующую процедуру уточнения (B). Рисунок 2. Светлое микроскопом образы уточнил сосудистой литой мозга. Мозг может быть отображены в различных плоскостях и на разных уровнях увеличения. Шкала Бар 200 мкм (А) и 50 мкм (Б). Рисунок 3. Пройдя через микроскоп изображение со скоростью 1x показывающие весь мозг взрослой мыши cerebrovasculature от спинной стороны. <IMG ALT = "Рисунок 4" SRC = "/ files/ftp_upload/2958/2958fig4.jpg" /> Рисунок 4. Микро-КТ изображений одного и того же весь мозг мыши взрослых показано на Рисунке 3 из спинной стороны. Рисунок 5. Применение сосудистых литья для выявления артериовенозной мальформации мозга. ) Микро-КТ сосудистых литой мозга показывает области увеличены, нерегулярные АВМ-подобных судов в правом полушарии с брюшной стороны. Увеличенное изображение области (белая коробка) показан справа. Б) То же нерегулярные суда визуализируются под микроскопом на светлое 50x увеличением. Шкала бар 50 мкм.