この記事では、我々は実行しやすいとイメージに成体マウスの脳の血管ツリーを利用することができる脳血管キャスティングのためのシンプルで実用的なテクニックを紹介。
血管イメージングは、脳動静脈奇形(BAVMs)などの脳血管疾患の臨床診断と管理に不可欠です。動物モデルは、脳血管疾患の病因論と潜在的な治療法を研究するために必要です。大動物用のイメージング血管系は比較的簡単です。しかし、マウスの脳の疾患モデルの血管撮像法を開発することにより、遺伝子組み換えマウスのラインのコストと可用性のが望ましい。イメージングは、マウス脳血管ツリーが課題です。人間と大きな動物、大血管での脈管構造学を評価するためのゴールドスタンダードでは(コンダクタンス)のレベルは、X線カテーテルコントラストベースの血管造影、小型げっ歯類には適していない方法です。
この記事では、我々は多くのdを使用して分析することができます動脈、静脈、毛細血管を含む、全体の血管床の耐久性のあるスケルトンを生成する脳血管キャスティングの手法を提案ifferentモダリティ。マウスcerebrovasculatureの微小血管の完全な鋳造が困難になる可能性がありますが、これらの課題は、このステップバイステップのプロトコールで対処されています。血管鋳造材料の心臓内の血流を介して、身体の全ての船舶は、キャストされています。脳を除去し、有機溶剤サリチル酸メチルを用いて明らかにすることができる。脳血管の三次元画像は、任意の従来の明視野顕微鏡や解剖顕微鏡で簡単にかつ安価に視覚化することができます。キャストcerebrovasculatureもイメージングおよびマイクロコンピュータ断層撮影(マイクロCT)1を用いて定量することができる。さらに、撮像された後、鋳物の脳は、組織学的分析のためのパラフィンに埋め込むことができます。
他の技術と比較して、この血管鋳造法の利点は、CTが原因で放射線不透過性の特性にスキャン、明視野顕微鏡分析など、さまざまな分析ツール、へその広範な適応です。材料だけでなく、組織学的および免疫組織化学的分析のteristic。組織のこの効率的な使用は、動物の使用量を節約し、コストを削減することができます。我々は最近、顕微鏡レベル2で成人BAVMのマウスモデルにおける不規則な血管を可視化し、マイクロCTスキャンによって撮像された不正な形式の船舶の追加のイメージを提供するために、この方法の応用を実証している。この方法は欠点を持っていると分析のすべてのタイプの理想的ではないかもしれないが、それは容易に学習し、広く体全体の血管の血管鋳造に適用することができる、シンプルで実用的なテクニックです。
ここでは、さまざまなモダリティで撮像される成体マウスのcerebrovasculatureの鋳造のための方法を報告する。疾患モデルBAVMにこのメソッドのアプリケーションは、不規則な血管の3次元解析が可能になります。潜在的な将来の研究では、マイクロCT画像の定量化、組織の組織学的分析、および血管疾患の進行の診断が含まれています。
一般的に発生する問題と提案
脳血管系の完全な血流が常に満たされるわけで。左心房や大動脈を破裂させずに遠位血管に到達するのに十分な圧力を有することは重要な問題です。これを克服するために、約100mmHgの一貫性のある圧力を適用する。また、大動脈にエージェントをキャストの適切な流出を確実にするために針位置を調整する。キャスティングエージェントは、脳の血管に到達できるように頸動脈が制限されていないことが重要です。あたりの改善小血管と相関する重要な手順融合は、以下のとおりです。血管から血液の(1)適切なクリアリング、鋳造剤の(2)ろ過、および鋳造剤注入時(3)針の配置。ケアは、左心房と肺にエージェントを鋳造の注入を避けるために注意すべきである。他の研究者が成功し、追加の手順を使用せずに、マウス3とラット4 cerebrovasculatureを灌流している。 hemotoxylinは93%の血管内腔の血流5を示したとMicrofil灌流血管の手動分析の対比。常に破棄または完全にそれはすぐに重合し、そしてツールは複数の被験者のために使用することはできないとして鋳造剤と接触する任意のツールをきれいに。周囲のマウスの脳組織の明確化が困難な場合があります。サリチル酸メチルの浸漬の後、組織は、依然として血管のイメージングが困難、不透明表示されることがあります。適切な脱水と明確化を確保することがこの問題を解決する必要があります。アルコールとメチルの中にロッカーの脳組織を配置するalicylateの治療は、組織の明確化を向上させることができます。
技術の欠点
この手法の限界は、(1)それはすぐに触媒を添加した後、それはすぐに濃くなるので、それを混合した後、鋳造剤溶液を注入することが必要であること、(2)キャストのエージェントは、容易に大きなコンダクタンスの船を埋め、そうではありません確実にこのような細動脈(抵抗血管)と毛細血管(栄養血管)などの小型船を、塗りつぶし、およびいくつかのグループは、マイクロCTイメージング1,6のためにMicrofilを好むものの、(3)それは、マイクロCTイメージングに最適なX線造影ではありません。しかし、適切な針の配置、船の位置と灌流圧を含む上記の提案の提案、以下、小血管の完全なキャスティングを実現することができます。様々な解析ツールへの適応性は、様々で、このエージェントは動脈と静脈の循環を含めて、脳の構造を分析するための貴重なツールとなります視点。
技術のアプリケーション
この方法の利点は、その広範な応用の可能性があります。キャストは動脈、静脈、および本体内のすべての組織の毛細血管を含むすべての船舶を、いっぱいになる、様々な種の複数の臓器の血管構造を解析するため。以前、他のグループは、ヒト、サル9、羊10、ラット4,11,12、およびマウスの3,13の7大と小型の8隻は、この血流を使用している。我々は現在、健康と病気の状態2の両方で、マウスの脳内微小血管の構造を解析する上でこの技法を使用しての証拠を示しています。さらに、様々な臓器の血管の可視化を向上させるためにさまざまなサイズと異なる色の血管を灌流するために、様々な粘度とMicrofil解決方法があります。例えば、赤は淡い脳実質に容易に可視化すること、および黄色のコントラストもでできます。暗赤色心筋。また、材料が放射線不透過性であるため、血管系は、マイクロCTは、3D回転可能な画像を得るためにスキャンで撮像することができます。組織はまた、撮像された後パラフィン切片と組織学的分析に使用することができます。
結論
我々はここにcerebrovasculatureの形態学的構造を研究するために分析の様々な技法を用いて適応することができます成体マウスの脳の血管の血管鋳型を作るためにプロトコルを示す。我々はまた、動脈から静脈循環へシャント血その拡大、不規則な形状の容器に代表される、BAVMの疾患の状態のモデルにこの方法の応用のための証拠を提供している。利用可能な血管の鋳造方法には、さまざまなものがあります。我々は血管鋳型のためにここに提供するシンプルなプロトコルは、様々な画像診断法を用いて成体マウスの脳の血管を調べるためのツールとして使用することができます。
The authors have nothing to disclose.
著者は、原稿の準備の支援についてヴォルテールGungabに感謝。この作品は、からの助成金によって部分的にサポートされていました:H.蘇に国立衛生研究所(T32 GM008440 WLヤングとH.蘇へEJウォーカー、WLヤングにR01 NS27713、NS44155 P01へ)、およびR21 NS070153、とアメリカ人心臓協会(H. suのAHA 10GRNT3130004)。
Name | Company | Catalogue number | Notes |
Microfil | FlowTech, Inc. | MV130 | 4 month shelf life |
Methyl Salicylate | Fisher Scientific | O3695-500 | to clarify tissue |