יציקה של כלי דם במוח העכבר למבוגרים הדמיה 3D ו ניתוח מורפולוגי
Özet
במאמר זה, אנו מציגים טכניקה פשוטה, מעשית ליציקת כלי דם במוח כי הוא קל לביצוע, יכול להיות מנוצל על התמונה עץ כלי דם של המוח עכבר מבוגר.
Abstract
דם הדמיה היא קריטית באבחון וניהול קליניים של מחלות כלי דם במוח, כגון מומים במוח arteriovenous (BAVMs). במודלים של בעלי חיים נחוצים לחקר טיפולים etiopathology ואת הפוטנציאל של מחלות כלי דם במוח. דימות vasculature בבעלי חיים גדולים יחסית קל. עם זאת, בפיתוח שיטות הדמיה של כלי מודלים המחלה Murine המוח רצוי בשל העלות והזמינות של גנטית שונה קווי העכבר. הדמיה העץ Murine כלי הדם המוחיים היא אתגר. בבני אדם ובבעלי חיים גדולים יותר, תקן הזהב להערכת angioarchitecture ב macrovascular (מוליכות) רמה רנטגן קטטר בניגוד מבוססי אנגיוגרפיה, שיטה לא מתאים מכרסמים קטנים.
במאמר זה, אנו מציגים שיטה של יציקת מוחי שמייצר שלד עמיד המיטה כלי דם, כולל עורקים, ורידים, נימים, כי יכול להיות מנותח באמצעות d רביםifferent לאופנים. הליהוק השלם של microvessels cerebrovasculature של העכבר יכול להיות קשה, אך אתגרים אלה מופנים בפרוטוקול צעד אחר צעד זה. באמצעות זלוף intracardial החומר הליהוק כלי הדם, כלי כל הגוף הם casted. המוח לאחר מכן ניתן להסיר הבהיר באמצעות salicylate מתיל ממס אורגני. שלושה ממדי הדמיה של כלי הדם במוח ניתן דמיינו פשוט ובזול עם מיקרוסקופ כל brightfield קונבנציונלי או ביתור מיקרוסקופ. Cerebrovasculature casted יכול להיות גם צילמו לכמת באמצעות מיקרו טומוגרפיה ממוחשבת (CT מיקרו) 1. בנוסף, לאחר הדמיה, המוח casted יכול להיות מוטבע פרפין לניתוח היסטולוגית.
היתרון של שיטה זו הליהוק וסקולרית לעומת טכניקות אחרות, הוא הסתגלות הרחב לכלים אנליטיים שונים, לרבות ניתוח brightfield מיקרוסקופיים, סריקת CT עקב המאפיינים radiopaqueteristic של החומר, כמו גם ניתוח היסטולוגית ו immunohistochemical. זה ניצול יעיל של רקמות יכול לחסוך את השימוש בבעלי חיים ולהפחית עלויות. הוכחנו לאחרונה יישום של שיטה זו כדי להמחיש את כלי הדם לא סדיר במודל של עכברים של BAVM מבוגר ברמה מיקרוסקופית 2, ולספק תמונות נוספות של כלי פגום הדמיה על ידי מיקרו CT. אף על פי שיטה זו יש חסרונות ולא יכול להיות אידיאלי עבור כל סוגי הניתוחים, היא טכניקה פשוטה, מעשית זה ניתן ללמוד בקלות מיושמים באופן נרחב על הליהוק של כלי הדם של כלי הדם בכל הגוף.
Protocol
Discussion
אנו מדווחים כאן שיטה ליציקת cerebrovasculature של עכבר בוגר שעשויים להיות צילמו עם שיטות שונות. יישום של שיטה זו על BAVM המודל מאפשר ניתוח 3D מחלה של כלי סדיר. מחקרים עתידיים אפשריים כוללים כימות של מיקרו-CT תמונות, ניתוח היסטולוגית של רקמה, ואבחון של התקדמות מחלת כלי דם.
בעיות נפוצות נתקל והצעות
זלוף מלאה של כלי הדם במוח לא תמיד מושגת. לאחר לחץ מספיק כדי להגיע לכלי הדם דיסטלי ללא פקיעת אבי העורקים אטריום שמאלה או אתגר. כדי להתגבר על זה, להפעיל לחץ עקבי של כ 100mmHg. כמו כן, להתאים את מיקום המחט על מנת להבטיח יצוא מתאים הליהוק של סוכן אל תוך אבי העורקים. חשוב עורקי הראש אינן מוגבלות כל כך הסוכן הליהוק יכול להגיע כלי המוח. נהלים קריטי כי לתאם עם כלי קטן משופרת לכלהיתוך הם: (1) ניקוי נאות של הדם בכלי הדם מתוך: (2) סינון של הסוכן הליהוק; ו (3) מיקום המחט בזמן זריקה למלהק. יש להקפיד להימנע הזרקת הליהוק סוכן אל המבואה ריאה שמאל. חוקרים אחרים perfused בהצלחה העכבר 3 ו -4 cerebrovasculature עכברוש ללא שימוש נהלים נוספים. ניתוח ידניים כלי perfused Microfil counterstained עם hemotoxylin הראה 93 כלי% זלוף לומן 5. תמיד להתעלם לחלוטין או לנקות כל כלי בא במגע עם סוכן הליהוק, כפי שיופיע לפלמר במהירות, וכלים לא יכולה לשמש בנושאים רבים. הבהרה של הרקמה הסובבת במוח העכבר יכול להיות מאתגר. לאחר טבילה salicylate מתיל, הרקמה עדיין עשויים להיראות אטום, מה שהופך הדמיה כלי הקשה. הבטחת התייבשות בירור ראוי וצריך לפתור את הבעיה הזו. הצבת ברקמת המוח על כיסא נדנדה במהלך אלכוהול מתיל sהטיפול יכול לשפר alicylate הבהרה רקמות.
החסרונות של טכניקת
המגבלות של טכניקה זו כוללים: (1) יש צורך להזריק את הפתרון למלהק מיד לאחר ערבוב זה כמו שזה יהיה לעבות במהירות לאחר זרז נוסף, (2) סוכן הליהוק ממלא כלי מוליכות גדולים בקלות, אבל זה לא למלא כלי אמין יותר, כגון arterioles (כלי התנגדות) נימים (כלי התזונתי); ו (3) זה לא בניגוד radiopaque הטוב ביותר עבור מיקרו CT הדמיה, למרות קבוצות שמעדיפים Microfil עבור מיקרו CT הדמיה 1,6. עם זאת, בעקבות הצעות המוצע לעיל, כולל מיקום המחט תקין, עמדה הספינה ולחץ זלוף, יציקה מלאה של כלי קטן יכולה להיות מושגת. הסתגלות כלי ניתוח שונים עושה את זה סוכן כלי חשוב לניתוח מבנה מוחי, כולל במחזור עורקי וורידי, עם שונותפרספקטיבות.
יישומים של טכניקת
היתרון של שיטה זו הוא פוטנציאל היישום הרחב. צוות השחקנים ממלא את כל הכלים, כולל עורקים, ורידים, נימים של רקמה בתוך כל הגוף, כך מבנים כלי דם באיברים שונים של מינים שונים ניתן לנתח. בעבר, קבוצות אחרות השתמשו זלוף עבור 8 כלי גדול 7 וקטנים אדם, קוף 9, 10 כבשים, חולדה 4,11,12, ועכבר 3,13. אנו מציגים כעת עדות באמצעות טכניקה זו בניתוח מבנה microvessels במוח העכבר, במדינות שניהם בריאים וחולים 2. בנוסף, ישנם פתרונות Microfil עם viscosities שונים זמינים perfuse כלי בגדלים שונים וצבעים שונים על מנת לשפר את ההדמיה של כלי לאיברים שונים. לדוגמה, אדום ניתן דמיינו בקלות parenchyma המוח חיוור, צהוב ניגודים היטב עםאדום כהה שריר הלב. יתר על כן, החומר הוא radiopaque, vasculature ניתן הדמיה עם מיקרו-CT סריקה כדי לקבל תמונה rotatable 3D. הרקמה יכול לשמש גם עבור חלקים פרפין וניתוח היסטולוגית לאחר הדמיה.
מסקנה
אנו מדגימים כאן פרוטוקול לעשות יצוק כלי הדם של כלי הדם של המוח עכבר מבוגר, אשר ניתן להתאים באמצעות מגוון של טכניקות ניתוח כדי ללמוד את המבנה המורפולוגי של cerebrovasculature. יש לנו גם סיפק עדויות ליישום שיטה זו מודל של המדינה המחלה BAVM, המיוצג על ידי כלי מוגדל צורה אסימטרית כי המחלף דם עורקי וורידי תפוצה. יש מגוון של שיטות הליהוק וסקולרית זמין. פרוטוקול פשוט אנו מספקים כאן בגבס כלי הדם עשויים לשמש ככלי לבחון את כלי הדם של המוח המבוגר העכבר באמצעות שיטות הדמיה שונות.
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים וולטייר Gungab לסיוע בהכנת כתב היד. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי תרומות: המכון הלאומי לבריאות (T32 GM008440 אל EJ ווקר, R01 NS27713 אל WL יאנג, P01 NS44155 אל WL צעירים וה 'סו), וכן R21 NS070153 ל ח סו וכן האמריקאי Heart Association (AHA 10GRNT3130004 ל ח סו).
Materials
| Name | Company | Catalogue number | Notes |
| Microfil | FlowTech, Inc. | MV130 | 4 month shelf life |
| Methyl Salicylate | Fisher Scientific | O3695-500 | to clarify tissue |
Referanslar
- Bolland, B. J., Kanczler, J. M., Dunlop, D. G., Oreffo, R. O. Development of in vivo muCT evaluation of neovascularisation in tissue engineered bone constructs. Bone. 43, 195-202 (2008).
- Walker, E. J. Arteriovenous malformation in the adult mouse brain resembling the human disease. Ann. Neurol. , (2011).
- Iqbal, U. Kinetic analysis of novel mono- and multivalent VHH-fragments and their application for molecular imaging of brain tumours. Br. J. Pharmacol. 160, 1016-1028 (2010).
- Fukunaga, A., Kawase, T., Uchida, K. Functional recovery after simultaneous transplantation with neuro-epithelial stem cells and adjacent mesenchymal tissues into infarcted rat. 145, 473-480 (2003).
- Chugh, B. P. Measurement of cerebral blood volume in mouse brain regions using micro-computed tomography. Neuroimage. 47, 1312-1318 (2009).
- Marxen, M. MicroCT scanner performance and considerations for vascular specimen imaging. Med. Phys. 31, 305-313 (2004).
- Barger, A. C., Beeuwkes, R., 3rd, L. a. i. n. e. y., L, L., Silverman, K. J. Hypothesis: vasa vasorum and neovascularization of human coronary arteries. A possible role in the pathophysiology of atherosclerosis. N. Engl. J. Med. 310, 175-177 (1984).
- Fossett, D. T., Caputy, A. J. . Operative Neurosurgical Anatomy. , (2002).
- Reynolds, D. G., Brim, J., Sheehy, T. W. The vascular architecture of the small intestinal mucosa of the monkey (Macaca mulatta). Anat. Rec. 159, 211-218 (1967).
- Bernard, S., Luchtel, D. L., Polissar, N., Hlastala, M. P., Lakshminarayan, S. Structure and size of bronchopulmonary anastomoses in sheep lung. Anat. Rec. A. Discov. Mol. Cell. Evol. Biol. 286, 804-813 (2005).
- Brady, J. M., Cutright, D. E. A new technique of measuring blood vessel volume in bone applied to the mandible and humerus of the rat. Anat. Rec. 170, 143-146 (1971).
- Evan, A. P., Dail, W. G. Efferent arterioles in the cortex of the rat kidney. Anat. Rec. 187, 135-145 (1977).
- Murphy, P. A. Endothelial Notch4 signaling induces hallmarks of brain arteriovenous malformations in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 10901-10906 (2008).
