成年鼠脑铸造三维成像和形态分析

1。清除血液从血管 100毫克/千克10毫克/千克0.25 ml生理盐水稀释甲苯噻嗪对氯胺酮腹腔注射麻醉小鼠。 一旦证实一爪子掐无反应，麻醉已通过膜片切割剪刀，略低于xyphoid过程，使整个胸部切口，剪刀切背，腹段的肋骨暴露胸腔之间。折叠起来胸骨和邻近胸壁和安全与止血暴露心脏。用镊子打开心包囊，暴露心脏。 打开连接到温暖PBS加肝素（5单位/毫升）热水澡的解决方案，在37 ° C和22钝的针头流出管。灌注泵（100mmHg压力） 针插入左心室，靠近心脏的顶点。立即切开右心房，使全身的血液流出，并继续冲洗，直到血我从流通中删除的小号。 2。铸造代理灌注到血管系统准备Microfil（流技术，公司卡佛，马）铸造每制造商的协议解决方案：混合与4毫升过滤的MV化合物的MV稀释液5毫升。加入450μl的催化剂（5％）（MV固化剂）。解决方案的工作时间是20分钟，但混合使用前，以确保适当的粘度。 撤柜铸造成10ml注射器剂溶液，将一种生硬的20号针头注射器和填充的解决方案针。 通过使用相同的孔冲洗血液进入左心室插入针。安全进针，止血钳对心脏的地方。 慢慢进入左心室注入铸造剂溶液约3毫升/分钟。压力过大，可能会导致不正确的流量铸造代理人或潜在的血管破裂。 寻找成功灌注的迹象，包括：可视化铸造在小肠和肝脏血管，远端肢体变色，鼻子和舌头变色剂。调整针，如果要达到适当的灌注。 3。收集和组织处理大脑和4％多聚甲醛，放置过夜取出4 ° C。 从多聚甲醛直接放置到越来越多地集中在室温乙醇脱水大脑：25％乙醇，1天，50％乙醇，1天，75％的乙醇，1天，95％乙醇，2天;和100％乙醇，2天。 澄清沉浸在水杨酸甲酯在室温下2天灌注脑血管周围脑组织。 整个unsectioned澄清脑血管可与水杨酸甲酯沉浸在在解剖显微镜（图1）（徕卡MZFL第三显微镜，徕卡显微系统，班诺克本，白细胞介素）或明场显微镜（图2）（徕卡马克/下的脑成像LS，莱卡微系统）。 Reclarification可以做，如果组织没有完全清除。从水杨酸甲酯，脑转移，95％的乙醇2天，2天100％的乙醇，水杨酸甲酯2天。 4。显微CT成像或组织学的应用，组织准备大脑可以使用后直接澄清或再水化后（图4）显微CT成像。 为了准备脑组织作病理分析，补充水分通过串行稀释乙醇的大脑：100％乙醇，1天，95％乙醇，1天，75％乙醇，1天，50％乙醇，2天; 25％乙醇，2天;并存储在PBS。大脑可以被嵌入在使用一个标准程序石蜡。 5。代表性的成果血管铸型后，可以看到cerebrovasculature，从宏观上脑表面（图1a）。实质内的血管树可以可视化的以下澄清（图1B）。详细的血管结构可成像和分析下一个明场显微镜（图2），解剖的范围（图3），并与微CT扫描（图4）。使用明场显微镜，血管可以被视为不同的焦平面，没有在更高的放大倍率（图2B）切片的大脑（图2A）以及个人微血管。解剖的范围下，人们可以看到一个焦平面整个血管结构，从而实现了更好的三个cerebrovasculature的三维结构（图3）可视化。在解剖显微镜下拍摄的图像可以显示大血管的形态和全脑血管，但缺乏与明场显微镜（图2B）拍摄的照片显示的细节。这项技术使我们能够检测不规则的船只，在我们的实验BAVM成年小鼠模型 2 。图5显示了一个微型CT扫描（图5A）和明场显微镜（图5B）检测相同的不规则血管的例子。总之，这数据显示，我们可以分析吨他同一个样品后血管铸型多种成像工具。 图1。整个鼠脑血管铸型。前（a）和（二）澄清水杨酸甲酯溶剂后。船只可以清楚地显示脑表面（A）和实质以下澄清程序（二）。 图2。明视显微镜图像澄清血管铸造大脑。大脑可以在各种飞机和在不同的放大倍率级别成像。比例尺为200μm（A）和50微米（二）。 图3。剖析1倍显微镜图像显示整个成年小鼠大脑cerebrovasculature从背视图。 <IMG ALT =“图4”SRC =“/ files/ftp_upload/2958/2958fig4.jpg”/> 图4。显微CT扫描相同的整体成年小鼠大脑从背视图图3所示的图像。 图5。血管铸型方法检测脑动静脉畸形中的应用。一）微铸造大脑血管的CT扫描显示区域的扩大，动静脉畸形不规则状大脑右半球的船只，从腹面观。显示在右边的区域放大后的图像（白盒）。 b）同不规则的血管可视化明场显微镜下，在50倍放大倍率。比例尺50微米。