A Pele Tridimensional Humanos Reconstruir Modelo: uma Ferramenta para o Estudo da Pele Normal e Progressão Melanoma

1. A Pele Tridimensional Humanos Reconstruir Modelo: Preparação da camada acelular: Misturar os reagentes a seguir em um tubo de 50 mL no gelo: 0,59 mL EMEM 10X, 50 ul 200mM L-glutamina, 0,6 mL FBS, 120 mL de bicarbonato de sódio 7,5% e 4,6 mL de colágeno bovino I. Adicione 1 mL de a mistura em cada inserção de bandejas de cultura de tecidos. Incubar por 30 min à temperatura ambiente e permitir que o gel solidificar. Cor da mistura deve ser de amarelo-palha para rosa. Trypsinize fibroblastos humanos a partir de frascos de cultura com 0,25% de tripsina / EDTA, adicione DMEM contendo 10% FBS para neutralizar. Coletar células por centrifugação e 0,45 ressuspender x 10 6 células em 1,5 mL DMEM com 10% de FBS. De células-tronco por via cutânea, recolher 6.600 esferas dérmica (quando as células-tronco dérmica crescer em meio de células-tronco, eles formam esferas de forma semelhante ao neurospheres) tocando frasco para separar as esferas, a centrifugação. Preparação da camada celular: Misture o seguinte em um tubo de 50 mL no gelo: 1,65 mL EMEM 10X, 150 mL 200 mM L-glutamina, 1,85 mL FBS, 350 mL de bicarbonato de sódio 7,5%, 14 mL de colágeno I bovino e 1,5 mL de suspensão fibroblastos a partir do passo 2 (em alternativa, usar combinação de 0,45 x 10 6 fibroblastos dérmicos e 6600 esferas em 1,5 mL de pele médio I para reconstruir células-tronco dérmica reconstrói), misture bem. Adicionar 3 mL da mistura a cada inserção camada revestido acelular. Incubar por 45 min a 37 ° C em um 5% CO 2 de cultura de tecidos incubadora. Cor da mistura deve ser de palha amarelo para rosa. Depois que o gel solidifica, adicione DMEM contendo 10% FBS (2 dentro mL e 10 mL fora de inserir em cada poço da pele reconstruir bandejas). Incubar durante 4 dias e certifique-se que os contratos de gel. Aspirar médio de ambos dentro e fora de cada inserção. Adicionar lavar médio (HBSS com 1% dialisadas FBS) 2 mL para o interior e 10 mL para o exterior de inserção, a fim de lavar soro regular. Incubar por 1 hora a 37 ° C. Preparação da pele reconstruir médio: Para células-tronco dos melanócitos normais e dérmica reconstrói: Para fazer meio básico (500 mL), misturar os reagentes a seguir: 490 mL meio isento de soro de queratinócitos, 1,8 mL extrato de hipófise de bovinos, 10 mL de soro fetal bovino dialisado, 500 mL de 10 mg / mL SCF, 562,5 mL de 4 mcg / mL bFGF e 500 mL de 264 mcg / mL ET-3. Médio I: Adicione 10 mL EGF de 100 mcg / ml a 100 ml de meio básico. Médio II: Adicione 2 mL EGF para 100 ml de meio básico. Médio III: Adicionar 720 mL CaCl 2 de 1 M a 300 mL de médio básica. Para a pele melanoma reconstruir: Para fazer Médio I (100ml), misture os seguintes reagentes: 72,5 mL de DMEM, 24 mL de F12 (HAM); 2 mL L-glutamina de 200 mm, 200 hidrocortisona mL de 269 g / mL, 200 ITES mL de 500X, 200 mL O-phosphorylethanolamine de 0,05 M, 200 mL de adenina de 90 mM, 200 mL de progesterona de 2 nM, 240 mL CaCl 2 de 1 M, 200 Triiodotironina mL de 10 nM e 100 ul de soro bovino chelexed recém-nascido (dissolver 3 g de Chelex 100 em 100 mL de soro, mexa 1,5 horas a 4 ° C, filtro de esterilizar). Para fazer Médio II (100ml), misture os seguintes reagentes: 72,5 mL de DMEM, 24 mL de F12 (HAM); 2 mL L-glutamina de 200 mm, 200 hidrocortisona mL de 269 g / mL, 200 ITES mL de 500X, 200 mL O-phosphorylethanolamine de 0,05 M, 200 mL de adenina de 90 mM, 200 mL de progesterona de 2 nM, 240 mL de CaCl2 1 M, 200 Triiodotironina mL de 10 nM e 100 mL de soro bezerro recém-nascido. Para fazer Médio III (300ml), misture os seguintes reagentes: 142,5 mL de DMEM, 142,5 mL de F12 (HAM é), 6 mL de L-glutamina de 200 mm, 600 hidrocortisona mL de 269 g / mL, 600 ITES mL de 500X , 600 mL O-phosphorylethanolamine de 0,05 M, 600 mL de adenina de 90 mM, 600 mL de progesterona de 2 nM, 720 mL CaCl 2 de 1 M, 600 Triiodotironina mL de 10 nM e 6 mL de soro bezerro recém-nascido. Trypsinize queratinócitos humanos a partir de frascos de cultura com 0,05% de tripsina / EDTA, neutralize com tripsina de soja inibidor de tripsina (250 mg / L em 1x tampão fosfato salina), spin down, ressuspender um pellet de células de 4,17 x10 6 células / mL na pele reconstruir médio I. Trypsinize melanócitos humanos ou células de melanoma a partir de frascos de cultura com 0,05% de tripsina / EDTA, neutralizar tripsina de soja com inibidor de tripsina de feijão, spin down, ressuspender um pellet de células de 0,83 x10 6 células / mL na pele reconstruir I. médio Retirar a roupa meio de ambos dentro e fora de cada inserção. Adicionar pele reconstruir médio I (1,5 mL para o interior e 10 mL para o exterior de cada inserção). Tomar 600 mL suspensão celular de queratinócitos e 600 mL suspensão celular dos melanócitos ou células de melanoma, misture bem. Dispense 200 mL queda suspensão mista de células por cair para o interior de cada inserção. Para reconstruir células-tronco por via cutânea, use 100 ml de suspensão de queratinócitos só. Incubar por 2 dias a 37 ° C. Pele Aspirar reconstruir médio Ide ambos o interior ea parte externa de cada inserção. Adicionar pele reconstruir médio II (2 mL para o interior e 10 mL para o exterior). Incubar por mais 2 dias a 37 ° C. Pele Aspirar reconstruir II médio do interior eo exterior de cada inserção, adicionar 7,5 mL de pele reconstruir III médio e apenas a parte externa. A partir deste ponto, a superfície do reconstrói começa a ser exposta ao ar. III mudança médio em dias alternados até o dia 18. Pele colheita reconstruir no dia 18: Aspirar a mídia do interior eo exterior de inserções. Remover inserções a partir da bandeja com uma pinça. Cortar a reconstruir (incluindo o filtro de policarbonato), traçando um círculo perto da borda com uma lâmina de bisturi. Corte a reconstruir e o filtro ao meio sobre uma superfície dura. Para seções de parafina: coloque metade da reconstrução de uma cassete histologia entre 2 preto papéis TBS biópsia e mergulhe a fita toda em formalina 10% por mais de 4 horas. Em seguida, coloque a fita em etanol 70% e armazená-lo a 4 ° C até que esteja pronto para processar a reconstruir para inclusão em parafina. Para seções congeladas: Coloque a outra metade de reconstruir em sacarose 50% a 4 ° C por 1-2 horas, em seguida, altere a sacarose para 2M e armazená-lo a 4 ° C por mais de 1-2 horas. Dispense ótima media temperatura de corte de congelamento (OCT) em um molde de base descartáveis ​​para que ele preenche cerca de 50% do barco. Evitar bolhas no outubro Agarre a borda da reconstrução com uma pinça e retire a reconstruir a partir da sacarose. Coloque-o em Kimwipes até o Kimwipes absorver a sacarose. Transferir a reconstruir no molde de base em cima do OCT, usando uma pinça e uma espátula. Cubra o topo da reconstruir com outubro mais até que o molde base é completamente cheio. Certifique-se de que você não tem as bolhas do PTU que fará corte difícil. Coloque o molde base de maneira uniforme em gelo seco esmagado, e permitir que o OCT para congelar completamente. Enrole o molde base em folha de estanho e armazená-lo a -70 ° C até que esteja pronto para cortá-la com um criostato. Um enxerto de pele reconstruir em um mouse: Preparar um tubo falcon de 50 mL com 5 mL de DMEM (para congelamento e descongelamento da pele do rato). Use uma fêmea de rato sem pêlo SCID outbred cerca de 6 semanas. O mouse é anestesiado com (sistema de anestesia EZ) isoflurano: anestesia inicial é realizada na câmara de indução à anestesia isoflurano 4% (antes do mouse é movido para o leito cirúrgico) e manter, através de um respiradouro nosecone durante o procedimento (isoflurano: 1,5-2% ). Apoio de calor por uma almofada aquecida para evitar hipotermia e lubrificante oftálmica estéril aplicada para evitar lesões oculares durante a anestesia. Coloque 600 mL de água num copo e deixe em cima de uma chapa quente para manter a temperatura da água entre 40-60 ° C. Limpe a pele do rato com tintura composta benjoim e compressas de preparação de álcool. Marcar uma linha na parte superior das costas do mouse para manter a mesma posição para suturar depois. Corte um leito da ferida redonda de cerca de 1,2 cm de diâmetro na parte de trás do rato superior usando tesouras e pinças Iris. Cobrir o leito da ferida com esponjas gaze estéril. Coloque a pele do rato rodada em 5 mL de DMEM, em seguida, deixar em recipiente de nitrogênio líquido, até que totalmente congelado. Descongele o tubo em água quente em cima de uma chapa quente até que totalmente descongelado. Repita 3 vezes. Retire a pele reconstruir a partir do transwell utilizando lâmina cirúrgica e remover a membrana com muito cuidado, a transferência da pele reconstruir (lado epiderme para cima) em cima do leito da ferida. Coloque a pele do rato (lado epiderme para cima) em cima da pele reconstruir. Fazer a primeira sutura no marcador previamente identificados, a segunda no fundo, então mais duas suturas em lados para corrigir a pele do rato. Pele do rato limpa após a enxertia. Remover nosecone e manter mouse sobre a almofada aquecida até acordado e ambulatorial. Coloque o mouse em uma nova gaiola. Analgesia pós-operatória: Meloxicam (1 mg / kg) por injeção subcutânea imediatamente após a cirurgia, 24 horas e 48 horas após a cirurgia. 2. Resultados representativos: Reconstrói a pele com melanócitos normais e células-tronco por via cutânea Reconstrói a pele são cultivadas em uma bandeja de 6 bem especial com inserções. O compartimento dérmico é cultivada em DMEM com SFB 10% para os primeiros quatro dias (Fig. 1A). A pele reconstruir médio I é usado quando os queratinócitos são semeados com melanócitos ou células de melanoma (Figura 1B). A epiderme é exposta ao ar no dia 9, o que permite diferenciar os queratinócitos (Fig. 1C). No dia 18, a epiderme da pele reconstrói é composto de camadas estratificadas dos queratinócitos. A camada basal indiferenciado e camadas seqüencialmente diferenciados são orientados verticalmente (Figura 1D). Manchaing a seção de reconstrói com o marcador melanocítico S100 mostra que os melanócitos estão alinhados na camada basal da epiderme e se comunicar com os queratinócitos através de extensões múltiplas dendrite (Fig. 1E). O compartimento dérmico contém fibroblastos incorporado em uma matriz de colágeno tipo I. Depositado colágeno IV indica a membrana basal, que separa a epiderme da derme (Fig. 1F). Quando as células-tronco por via cutânea (marcada com GFP lentiviral vetor) são encaixados com fibroblastos em uma matriz de colágeno I, eles migram para a epiderme e diferenciam-se em melanócitos (1), (Fig. 2). Várias camadas de queratinócitos na epiderme são desenvolvidas. Reconstrói a pele de tumores de melanoma Estudos clinicopatológicos indicam que melanomas progresso de uma forma faseada: nevos comuns adquiridos, nevos displásicos, RGP (fase de crescimento radial) melanomas, VGP (fase de crescimento vertical) melanomas metastático e melanomas (7). Diferentes estágios de linhas de células de melanoma são morfologicamente semelhantes entre si em 2 D-cultura (Fig. 3A-D), mas quando eles são incorporados na pele reconstrói, o comportamento das células reflete suas características em vivo. A localização ea taxa de crescimento dos melanócitos normais são rigidamente controlada na pele reconstrói (Fig. 3E). RGP melanomas primários WM35 proliferam predominantemente na epiderme (Fig. 3F), enquanto VGP melanomas WM793 crescer invasiva na derme (Fig. 3G). Metastático melanomas 1205Lu agressivamente invadir profundamente na derme (Fig. 3H). Figura 1. Reconstrói a pele com melanócitos normal. O aspecto macroscópico da pele reconstrói é mostrado na AC. Os fibroblastos A. misturado com colágeno são cultivadas em DMEM contendo 10% FBS e forma compartimento dérmico. Os queratinócitos e melanócitos B. são semeados em cima da derme e crescer na pele reconstruir médio. C. A epiderme é exposta ao ar no dia 9. D. H & E-manchada pele reconstruir apresenta a epiderme composta verticalmente, camada basal orientado, e sequencialmente diferenciada camadas de células estratificadas. A derme contém fibroblastos incorporado em uma matriz de colágeno tipo I. E. S100-positivos melanócitos (setas pretas) são alinhados à membrana basal e se comunicar com os queratinócitos múltiplas. F. Colágeno IV coloração indica a membrana basal, que separa a epiderme da derme. Todas as colorações no DF foram realizados em formalina-fixo, parafina seções. Figura 2. Células-tronco dérmica na pele reconstrói migram para a epiderme e diferenciam-se em melanócitos. No dia 5 após a semeadura queratinócitos, células GFP positivas única (verde) iniciar a migração para fora das esferas. A epiderme é ainda composto por uma única camada. No dia 8, algumas células chegar a interface epiderme derme. De dia 10, GFP células positivas estão fortemente alinhados na posição de membrana basal. A GFP positivas migraram células da epiderme marcador melanocítico expressar HMB45 (vermelho, como indicado por setas brancas). Núcleos são corados com DAPI (azul). A epiderme é desenvolvido como múltiplas camadas. A membrana basal é indicado com linhas brancas pontilhadas. Figura 3. Reconstrói a pele de diferentes estágios de melanomas: AD. Melanócitos normais e células de melanoma cultivadas em culturas 2D. Os melanócitos A. de prepúcio. B. RGP WM35 células. C. VGP WM793 células. D. 1205Lu metastático de células de melanoma. E. melanócitos normais são localizados na membrana basal. F. melanoma RGP WM35 células crescem como aglomerados de células da epiderme. G. melanoma VGP WM793 invadir células na derme através da membrana basal. H. Melanoma metastático 1205Lu células invadem agressivamente em profundidade da derme. Solução de problemas Problema Solução de problemas Mistura de colágeno não solidificar Cor mistura de colágeno deve ser amarelo-palha a rosa, caso contrário, o pH é errado e pode não colágeno gel. Se a cor é amarela, bicarbonato de sódio mais deve ser adicionado gota a gota. Colágeno prematuramente precipita na mixuture Manter todos os componentes no gelo até que a mistura de colágeno é colocada sobre a inserção Colágeno contratada não é mesmo (um lado é mais grosso que o outro lado) Calibrar a prateleira de incubadora A epiderme é formado com menos de três camadas de queratinócitos. Use queratinócitos indiferenciado em passagens inferiores