Die dreidimensionalen humanen Haut Rekonstruieren Modell: ein Tool für normale Haut und Melanom Progression Study

1. Die dreidimensionalen humanen Haut Rekonstruieren Model: Vorbereitung der azelluläre Schicht: Mischen Sie die folgenden Reagenzien in einem 50 ml-Röhrchen auf Eis: 0,59 ml 10x EMEM, 50 ul 200 mM L-Glutamin, 0,6 mL FBS, 120 ul 7,5% Natriumbicarbonat und 4,6 mL Rinder-Kollagen I. 1 mL Die Mischung in jeder Einsatz der Gewebekultur Tabletts. Inkubieren für 30 min bei Raumtemperatur und damit das Gel zu erstarren. Farbe der Mischung sollte aus Stroh-gelb bis pink werden. Trypsinize menschlichen Fibroblasten aus Kulturflaschen mit 0,25% Trypsin / EDTA, fügen DMEM mit 10% FBS zu neutralisieren. Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation und Resuspendieren 0,45 x 10 6 Zellen in 1,5 ml DMEM mit 10% FBS. Für die dermale Stammzellen sammeln 6600 dermal Kugeln (wenn dermale Stammzellen in Stammzell-Medium wachsen, bilden sie Kugeln in einer ähnlichen Weise wie Neurosphären), indem Sie auf Kolben auf die Kugeln, Zentrifugation zu trennen. Vorbereitung der zellulären Ebene: Mischen Sie die folgenden in einer 50 ml-Röhrchen auf Eis: 1,65 ml 10x EMEM, 150 ul 200 mM L-Glutamin, 1,85 mL FBS, 350 ul 7,5% Natriumbicarbonat, 14 mL Rinder-Kollagen I und 1,5 mL Fibroblasten Aufhängung von Schritt 2 (alternativ verwenden Kombination von 0,45 x 10 6 Fibroblasten und 6600 dermal Kugeln in 1,5 ml der Haut zu rekonstruieren Medium I zur dermalen Stammzellen rekonstruiert), gut mischen. Add 3 mL der Mischung auf jeden azelluläre Schicht beschichtet einzufügen. Inkubieren für 45 min bei 37 ° C in einer 5% CO 2 Gewebekultur-Inkubator. Farbe der Mischung sollte aus Stroh gelb bis pink werden. Nachdem das Gel erstarrt, fügen DMEM mit 10% FBS (2 mL innen und 10 mL außerhalb des Einsatzes in jede Vertiefung der Haut zu rekonstruieren Trays). Inkubieren für 4 Tage und stellen Sie sicher, dass das Gel Verträge. Absaugen Medium von innen und außen jedes Einsatzes. Add Waschmedium (HBSS mit 1% dialysiert FBS) 2 mL nach innen und 10 mL nach außen zu legen um abwaschen regelmäßige Serum. Inkubation für 1 Stunde bei 37 ° C. Vorbereitung der Haut zu rekonstruieren Medium: Für den normalen Melanozyten und dermalen Stammzellen rekonstruiert: Um Basismedium (500 mL) zu machen, mischen die folgenden Reagenzien: 490 ml Keratinozyten-serum-freiem Medium, 1,8 ml Rinder-Hypophysen-Extrakt, 10 ml dialysiert Rinderfötenserum, 500 ul von 10 pg / mL SCF, 562,5 ul 4 pg / mL bFGF und 500 ul von 264 pg / mL ET-3. Medium I: Fügen Sie 10 ul EGF von 100 ug / ml bis 100 ml Basismedium. Medium II: In 2 ul EGF auf 100 ml Basismedium. Medium III: In 720 ul CaCl 2 von 1 M bis 300 ml Basismedium. Für Melanome der Haut zu rekonstruieren: Um Medium I (100 mL), mischen Sie die folgenden Reagenzien: 72,5 ml DMEM, 24 ml F12 (HAM), 2 ml L-Glutamin von 200 mm, 200 ul Hydrocortison von 269 g / mL, 200 ul ITES von 500X, 200 ul O-phosphorylethanolamine von 0,05 M, 200 ul Adenin von 90 mm, 200 ul Progesteron von 2 nM, 240 ul CaCl 2 von 1 M, 200 ul Trijodthyronin von 10 nM und 100 ul chelexed Neugeborenen Kälberserum (löst 3 g Chelex 100 in 100 ml Serum, rühren 1,5 Stunden bei 4 ° C, Filter sterilisieren). Um Medium II (100 mL), mischen Sie die folgenden Reagenzien: 72,5 ml DMEM, 24 ml F12 (HAM), 2 ml L-Glutamin von 200 mm, 200 ul Hydrocortison von 269 g / mL, 200 ul ITES von 500X, 200 ul O-phosphorylethanolamine von 0,05 M, 200 ul Adenin von 90 mm, 200 ul Progesteron von 2 nM, 240 ul CaCl2 von 1 M, 200 ul Trijodthyronin von 10 nm und 100 ul Neugeborenen Kälberserum. Um Medium III (300ml), mischen Sie die folgenden Reagenzien: 142,5 ml DMEM, 142,5 ml F12 (HAM), 6 ml L-Glutamin von 200 mm, 600 ul Hydrocortison von 269 g / mL, 600 ul ITES von 500X , 600 ul O-phosphorylethanolamine von 0,05 M, 600 ul Adenin von 90 mm, 600 ul Progesteron von 2 nM, 720 ul CaCl 2 von 1 M, 600 ul Trijodthyronin von 10 nm und 6 mL Neugeborenen Kälberserum. Trypsinize humanen Keratinozyten aus Kulturflaschen mit 0,05% Trypsin / EDTA, neutralisieren Trypsin mit Soja-Trypsin-Inhibitor (250 mg / L in 1x phosphate buffered saline), Spin-Down, resuspendieren ein Zellpellet in 4,17 x10 6 Zellen / ml in der Haut zu rekonstruieren Medium I. Trypsinize menschlichen Melanozyten oder Melanomzellen aus Kulturflaschen mit 0,05% Trypsin / EDTA, neutralisieren Trypsin mit Soja-Trypsin-Inhibitor, Spin-Down, resuspendieren ein Zellpellet bei 0,83 x10 6 Zellen / ml in der Haut zu rekonstruieren Medium I. Entfernen Spülmedium von innen und außen jedes Einsatzes. Add Haut zu rekonstruieren Medium I (1,5 ml nach innen und 10 mL auf der Außenseite jedes insert). Nehmen Sie 600 ul Zellsuspension von Keratinozyten und 600 ul Zellsuspension von Melanozyten oder Melanomzellen, gut mischen. Geben Sie 200 ul Zellsuspension gemischt Tropfen für Tropfen an der Innenseite jedes Einsatzes. Für die dermale Stammzellen zu rekonstruieren, nutzen 100 ul der Keratinozyten-Suspension nur. Inkubieren für 2 Tage bei 37 ° C. Absaugen der Haut zu rekonstruieren Medium Isowohl aus dem Inneren und dem Äußeren eines jeden einzufügen. Add Haut zu rekonstruieren Medium II (2 mL nach innen und 10 mL nach außen). Inkubieren für weitere 2 Tage bei 37 ° C. Absaugen der Haut zu rekonstruieren Medium II von innen und außen jedes Einsatzes, fügen Sie 7,5 ml Haut zu rekonstruieren Medium III, um nur die Außenseite. Ab diesem Zeitpunkt rekonstruiert die Oberfläche beginnt zu der Luft ausgesetzt. Ändern Medium III jeden zweiten Tag bis zum Tag 18. Ernte Haut an Tag 18 zu rekonstruieren: Saugen Sie Medien aus dem Inneren und dem Äußeren der Einsätze. Entfernen Einsätze aus Fach mit einer Pinzette. Schneiden Sie die zu rekonstruieren (einschließlich der Polycarbonat-Filter) durch Verfolgung eines Kreises nahe an den Rand mit einem Skalpell. Schneiden Sie die Rekonstruktion und den Filter in der Hälfte auf eine harte Oberfläche. Für Paraffinschnitte: Ort der Hälfte der in einem histologischen Kassette zwischen 2 schwarz TBS Biopsie Papiere zu rekonstruieren und genießen das ganze Kassette in 10% Formalin für mehr als 4 Stunden. Dann legen Sie die Kassette in 70% Ethanol und speichern Sie sie bei 4 ° C, bis Sie bereit sind, die für Paraffineinbettung rekonstruieren zu verarbeiten. Für Gefrierschnitte: Legen Sie die andere Hälfte zu rekonstruieren in 50% Saccharose bei 4 ° C für 1-2 Stunden, dann ändern Sie die Saccharose zu 2M und speichern Sie sie bei 4 ° C für weitere 1-2 Stunden. Dispense optimale Schnittqualität Temperatur dem Gefrierpunkt Medien (OCT) in eine Einweg-Bodenform, so dass es etwa 50% des Bootes füllt. Vermeiden Sie Luftblasen im Oktober Besorgen Sie sich die Kante der mit einer Pinzette zu rekonstruieren und entfernen Sie die aus der Saccharose zu rekonstruieren. Legen Sie sie auf Kimwipes bis Kimwipes der Saccharose zu absorbieren. Übertragen Sie die in der Basisform auf der OCT zu rekonstruieren, mit einer Pinzette und einem Spatel. Decken Sie die Oberseite des mit mehr Okt rekonstruieren, bis die Basisform vollständig gefüllt ist. Achten Sie darauf, keine Luftblasen in den ÜLG, die machen das Schneiden schwieriger wird. Stellen Sie die Basisstation Form gleichmäßig auf zerstoßenem Trockeneis, und ermöglichen den ÜLG vollständig einfrieren. Wickeln Sie das Basis-Werkzeug in Alufolie und speichern Sie es bei -70 ° C bis Sie bereit sind, es mit einem Kryostaten geschnitten werden. Graft eine Haut einer Maus zu rekonstruieren: Bereiten Sie eine 50-ml-Falcon-Röhrchen mit 5 ml DMEM (zum Einfrieren und Auftauen der Haut von Mäusen). Verwenden Sie einen weiblichen SCID haarlosen Maus outbred rund 6 Wochen. Die Maus ist mit Isofluran (EZ Anästhesie-System): initial Anästhesie ist in der Induktion Kammer mit 4% Isofluran (vor Maus, um die chirurgische Bett bewegt wird) und zu pflegen Narkose durch eine nosecone Verschnaufpause während des Eingriffs durchgeführt (Isofluran: 1.5-2% ). Hitze Unterstützung durch ein Heizkissen auf Unterkühlung und sterile ophthalmologische Gleitmittel aufgetragen zu verhindern Augenverletzung während der Narkose zu verhindern. Setzen Sie 600 mL Wasser in ein Becherglas und lassen Sie auf einer heißen Platte, um die Wassertemperatur zwischen 40 halten – 60 ° C. Reinigen Sie die Haut von Mäusen mit Verbindung Benzoin-Tinktur und Alkohol prep Tupfer. Mark eine Linie auf der Oberseite der Maus wieder auf die gleiche Position zum Nähen später zu halten. Schneiden Sie einen runden Wundbett ca. 1,2 cm im Durchmesser auf der Maus den oberen Rücken mit Iris Schere und Pinzette. Bedecken Sie die Wunde Bett mit steriler Gaze Schwämme. Legen Sie die runde Haut von Mäusen in 5 ml DMEM, dann in flüssigem Stickstoff zu verlassen, bis es gefroren völlig. Defrost das Rohr in heißem Wasser auf einer heißen Platte, bis völlig aufgetaut. Wiederholen Sie die 3-fache. Lösen Sie die Haut vor dem Transwell mit Skalpell zu rekonstruieren und entfernen Sie die Membran sehr vorsichtig, übertragen Sie die Haut zu rekonstruieren (Epidermis nach oben) auf der Oberseite des Wundbett. Platzieren Sie die Maus Haut (Epidermis nach oben) auf der Haut zu rekonstruieren. Sprechen Sie die erste Naht auf die Markierung zuvor angegeben, die auf dem Boden, dann noch zwei weitere Nähte an den Seiten, um die Haut von Mäusen zu beheben. Reinigen Sie die Haut von Mäusen nach der Transplantation. Entfernen nosecone und halten Sie die Maustaste auf dem Heizkissen bis wach und gehfähig. Legen Sie die Maus in einen neuen Käfig. Postoperative Analgesie: Meloxicam (1 mg / kg) durch subkutane Injektion sofort nach der Operation, 24 Stunden und 48 Stunden nach der Operation. 2. Repräsentative Ergebnisse: Haut rekonstruiert mit normalen Melanozyten und dermalen Stammzellen Die Haut rekonstruiert werden in einem speziellen 6-well Schale mit Einsätzen kultiviert. Die dermale Kompartiment ist in DMEM mit 10% FBS für den ersten vier Tagen (Abb. 1A) kultiviert. Die Haut rekonstruieren Medium I wird verwendet, wenn Keratinozyten mit Melanozyten oder Melanomzellen (Abb. 1B) ausgesät werden. Die Epidermis ist die Luft am Tag 9 ausgesetzt und dies ermöglicht Keratinozyten zu unterscheiden (Abb. 1C). Am Tag 18, rekonstruiert die Epidermis der Haut ist der geschichtete Keratinozyten Schichten. Die undifferenzierten basalen Schicht und nacheinander differenzierten Schichten sind vertikal orientiert (Abb. 1D). FleckIng. dem Abschnitt rekonstruiert mit den melanozytären Marker S100 zeigt, dass Melanozyten in der basalen Schicht der Epidermis und die Kommunikation mit mehreren Keratinozyten durch Dendriten-Erweiterungen (Abb. 1E) ausgerichtet sind. Die dermale Kompartiment enthält Fibroblasten in einer Kollagen-Typ-I-Matrix eingebettet. Hinterlegt Kollagen IV zeigt die Basalmembran, die die Epidermis trennt sich von der Dermis (Abb. 1F). Wenn die Haut Stammzellen (beschriftet mit GFP lentiviralen Vektor) mit Fibroblasten in einer Kollagen I-Matrix eingebettet sind, sie auf die Epidermis migrieren und differenzieren sich in Melanozyten (1), (Abb. 2). Mehrere Schichten von Keratinozyten der Epidermis entwickelt. Haut rekonstruiert der Melanom-Tumoren Klinisch Studien zeigen, dass Melanome Fortschritte stufenweise: gemeinsame erworbenen Nävi, dysplastische Nävi, RGP (radial Wachstumsphase) Melanome, VGP (vertikale Wachstumsphase) Melanome und metastasierten Melanomen (7). Verschiedene Stadien der Melanom-Zelllinien sind morphologisch ähnlich zueinander in 2-D-Kultur (Abb. 3A-D), aber wenn sie in der Haut rekonstruiert eingebaut sind, spiegelt das Verhalten der Zellen ihre in vivo Eigenschaften. Die Lage und das Wachstum von normalen Melanozyten sind fest in der Haut rekonstruiert (Abb. 3E) gesteuert. RGP primären Melanome WM35 vermehren überwiegend in der Epidermis (Abb. 3F), während VGP Melanome WM793 invasiv wachsen in die Dermis (Abb. 3G). Metastasierten Melanomen 1205Lu aggressiv tiefen Invasion in die Dermis (Abb. 3H). Abbildung 1. Haut rekonstruiert mit normalen Melanozyten. Die Bruttomarge des Hautbildes rekonstruiert wird in AC dargestellt. A. Fibroblasten mit Kollagen vermischt werden in DMEM mit 10% FBS und Form dermale Fach gewachsen. B. Keratinozyten und Melanozyten sind oben auf der Dermis ausgesät und wachsen in der Haut zu rekonstruieren Medium. C. Die Epidermis ist die Luft am Tag 9 ausgesetzt. D. H & E-gefärbten Haut zu rekonstruieren präsentiert die Epidermis umfasst vertikal orientierten basalen Schicht und nacheinander differenziert geschichtet Zellschichten. Die Dermis enthält Fibroblasten in einer Kollagen-Typ-I-Matrix eingebettet. E. S100-positive Melanozyten (schwarze Pfeile) sind an der Basalmembran und die Kommunikation mit mehreren Keratinozyten ausgerichtet. F. Collagen IV-Färbung zeigt die Basalmembran, die die Epidermis trennt sich von der Dermis. Alle Färbungen in DF wurden auf Formalin-fixierten, in Paraffin eingebettete Schnitte durchgeführt. Abbildung 2. Dermal Stammzellen in der Haut rekonstruiert migrieren, um die Epidermis und differenzieren sich in Melanozyten. Am Tag 5 nach der Aussaat Keratinozyten, einzelne GFP-positive Zellen (grün) wandern aus Sphären zu beginnen. Die Epidermis ist noch aus einer einzigen Schicht besteht. Am Tag 8, erreichen ein paar Zellen der Epidermis-Dermis-Schnittstelle. Am Tag 10, GFP-positiven Zellen dicht an der Basalmembran Position ausgerichtet. Die migrierten GFP-positive Zellen in der Epidermis zum Ausdruck melanozytären Marker HMB45 (rot, dargestellt durch weiße Pfeile). Zellkerne sind mit DAPI (blau) gefärbt. Die Epidermis ist als mehrere Schichten entwickelt. Die Basalmembran ist mit weißen gepunkteten Linien angedeutet. Abbildung 3. Haut rekonstruiert der verschiedenen Stadien des Melanoms: AD. Normale Melanozyten und Melanomzellen in 2D Kulturen aufgewachsen. A. Melanozyten aus Vorhaut. B. RGP WM35-Zellen. C. VGP WM793-Zellen. D. metastasierendem Melanom 1205Lu Zellen. E. Normale Melanozyten sind an der Basalmembran befindet. F. RGP Melanom WM35 Zellen wachsen als Zellhaufen in der Epidermis. G. VGP Melanom WM793 Zellen eindringen in die Dermis durch Basalmembran. H. metastasierendem Melanom 1205Lu Zellen aggressiv in in Dermis tief. Fehlerbehebung Problem Fehlerbehebung Collagen Gemisch nicht erstarren Collagen Mischung Farbe sollte Stroh-gelb bis pink, sonst pH falsch und Kollagen kann nicht gel. Wenn die Farbe ist leuchtend gelb, sollte mehr Natriumbicarbonat tropfenweise hinzugefügt werden. Collagen vorzeitig fällt in der mixuture Halten Sie alle Komponenten auf Eis, bis die Kollagen-Gemisch auf den Einsatz platziert ist Vertraglich Kollagen ist nicht einmal (eine Seite ist dicker als die andere Seite) Kalibrieren Sie das Regal mit Inkubator Die Epidermis ist mit weniger als drei Keratinocytenschichten gebildet. Verwenden Sie undifferenzierten Keratinozyten bei niedrigeren Passagen