Nanopartículas fluorescentes para a medição da concentração de íons em Sistemas Biológicos

1. Preparação de optode Antes de fazer a optode, alíquotas dos componentes são necessidade para que eles possam ser facilmente medidos e armazenados. A 50 mg de sódio do ionóforo X (naix) e um frasco de sódio 50 mg tetraquis [3,5-bis (trifluorometil) fenil] borato (NaTFPB) cada um deles será criado em tetrahyrdofuran (THF) e alíquotas de 1,5 ml em tubos de centrifugação de poliestireno. Em uma Cobertura de vapores químicos, dissolver o de 50 mg de naix em 1 ml de THF no frasco de transporte e mistura para assegurar que o sólido tenha dissolvido completamente. Transferência de 100 ml desta solução para 10 tubos de centrífuga separados. Repita o procedimento para NaTFPB. Permitir que o THF para evaporar em uma Cobertura de vapores químicos durante a noite, os tubos de centrifugação rótulo e colocá-los no frigorífico grau 4 para o armazenamento. Isso cria cinco alíquotas mg de naix seco e NaTFPB. Dissolver o III Chromoionophore (CHIII) em 1 ml de THF e transferir para um frasco de vidro de 3 ml. Adicionar outro 1 ml de THF para o frasco de transporte CHIII para dissolver qualquer CHIII residual e adicionar esta para o frasco de vidro de 3 ml. Haverá um total de 2 ml agora. Transferir 1 ml da solução CHIII em THF a dois frascos separados 1,5 ml de vidro com tampas de Teflon um revestido. Conservar a solução CHIII no frigorífico grau 4, na concentração final de 5 mg / ml. Essas alíquotas e soluções serão usadas para fazer o material optode. Pipeta mL 66 de bis (2-etil-hexil) sebacato (DOS) em um frasco de vidro de 1,5 ml com tampa de rosca em Teflon – este é o frasco optode. DOS é uma solução viscosa para cuidados devem ser tomados para garantir a quantidade adequada de solução é transferido para o frasco. O volume corresponde a ~ 60 mg de DOS. Pesar 30 mg de alto peso molecular poli cloreto (PVC) (PVC) e transferir isso para o frasco optode. Agora adicione os componentes funcionais alíquotas para o frasco optode para criar o optode desejado. As concentrações relativas de CHIII, naix e NaTFPB irá determinar a resposta do sensor de sódio. Estas concentrações podem ser ajustados para ter um sensor que, idealmente, responde a concentrações intracelulares, com um Kd de 10 mM ou concentrações extracelular, com um Kd de 150 mM. Além disso, haverá provavelmente de lote para lote variabilidade dos produtos químicos do fornecedor e de calibração dos sensores é necessário determinar se a resposta correta está ocorrendo para cada novo lote de componentes químicos. Aqui nós descrevemos o método para criar um sensor com concentrações que são normalmente utilizados para medições de sódio intracelular. Em uma Cobertura de vapores químicos, a transferência de 100 l do 5 mg / ml CHIII em THF solução para o frasco optode. Dissolver 5 mg de naix em 300 ml de THF e transferir 300 ml para o frasco optode, este se correlaciona com 5 mg de naix. Dissolver uma alíquota de 5 mg do NaTFPB em 500 mL de THF e transferência de 20 l da solução para o frasco optode, este se correlaciona com 0,1 mg de NaTFPB. Adicionar 80 mL de THF ao frasco optode. A solução no frasco optode contém 30 mg de PVC, 60 mg de DOS, 5 mg de naix, 0,2 mg de NaTFPB, 0,5 mg de CHIII em 500 mL de THF. Suavemente vortex frasco este até que todos os PVC se dissolveu. O optode deve ser uma cor vermelha. A quantidade total de THF adicionada ao frasco deve ser de 500 mL, independentemente da relação de componentes utilizados. Permitir que o THF restante no naix e alíquotas NaTFPB para evaporar durante a noite e re-rotular o tubo com a quantidade correta de produtos químicos. 2. Criando nanosensores Pipetar 100 mL de 10 mg / ml 1,2-Distearoyl-sn-glicero-3-Phosphoethanolamine-N – [Methoxy (polietilenoglicol) -550] em clorofórmio (PEG lipídios) em um frasco de vidro 4 dram. Permitir que o clorofórmio para evaporar em uma Cobertura de vapores químicos. Este processo pode ser acelerado por secagem a solução com azoto ou ar da casa. Adicionar 4 ml da solução aquosa desejado para o frasco com PEG lipídios. Coloque o frasco em um jack de laboratório sob a ponta sonicando e elevar o frasco até que a ponta é cerca de 7 mm de profundidade na solução e sonicate a uma potência baixa sonicação por 30 segundos. Aqui usamos um Branson digitais sonifier definido para amplitude de 15% com um centímetro da ponta do chifre ½ passo diâmetro. A solução aquosa pode ser qualquer solução. Por exemplo, para determinar a resposta dos sensores usamos 10 mM HEPES pH 7,2 com base Trizma. Enquanto a solução está sendo sonicado, misturar 50 ul do material optode com 50 ul de diclorometano em um tubo de microcentrífuga de 0,6 ml. Misturar com a pipeta para garantir uma mistura uniforme. Ajuste o controle sonifier para sonicate por 3 minutos. Iniciar a sonicação e enquanto sonicando adicionar a solução de mistura optode ao frasco por imersão a ponta da pipeta na solução e dispensar as mL de solução 100 em uma rápida, a injeção mesmo. A solução deve ficar azul, depending na solução aquosa utilizada. Permitir que a sonicação para continuar por aproximadamente 30 segundos depois abaixe a tomada de modo que a ponta sonicando é de cerca de 2 mm de profundidade em solução. Isso deve começar a arejar a solução ea solução vai se tornar opaco. Este passo ajuda a remover a THF residual e diclorometano da solução. Uma vez sonicação é completa, puxar para cima a solução nanosensor para uma seringa de 5 ml. Anexar um filtro de seringa de 0,2 mm e dispensar a solução nanosensor em um frasco de vidro com tampa de tampa de rosca. A solução deve ser claro e azul se uma solução aquosa que contém menos de 10 mM de sódio e tem um pH inferior a cerca de 9 é usado. Caso contrário, ele não deve ter cor ou ser rosa. 3. Determinação da resposta nanonsensor Este método é usado para determinar a resposta de nanosensores projetado para medir de sódio intracelular. Concentrações diferentes são recomendados para ser usado para nanosensores concentração extracelular de sódio. Faça soluções estoque de 10 mM HEPES (0 Na) e cloreto de sódio 1M (NaCl) em 10 mM HEPES (1 M Na) e pH cada uma destas soluções para 7,2 usando base Trizma. Mix de soluções estoque de 0 e 1 M Na Na, em 50 ml tubos de centrífuga cônico para criar soluções com: 0, 1, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 500, 1000 mM concentrações de NaCl. Use um fundo óptico placa de 96 poços para determinar a resposta. Adicione 100 ml de cada concentração de sódio a 3 poços em uma coluna. Isto irá produzir uma série de 3 x 10 poços. A cada poço adicionar 100 ul de nanosensores preparados na hora e carregar em um fluorímetro de microplacas. Nós usamos um Molecular Devices Spectramax M3. Leia todos os poços com os comprimentos de onda a seguir: Excitação (nm) Emissão (nm) Cut-Off (nm) 488 570 530 488 670 610 639 680 665 A intensidade nanosensor em cada comprimento de onda é dependente da concentração de sódio. O uso do comprimento de onda depende das aplicações. Intracelular para medições lenta dinâmica, usamos 488 nm/570 nm (excitação / emissão) e 488 nm nm/670 que nos permitem a relação dois comprimentos de onda e reduzir o ruído. Tradicionalmente, optode dados são convertidos para um valor que são: α = (I – I min) / (I max – I min), onde I é a intensidade em uma concentração de sódio dado, eu min é a menor intensidade nas medidas de resposta , e eu max é a maior intensidade nas medidas de resposta. Converter se essa relação de intensidade a 570 nm dividida pela intensidade a 670 nm ou a intensidade a 680 nm para α. Use software de plotagem, Excel ou origem são normalmente utilizados em nosso laboratório, para traçar α versus o log da concentração de sódio, definindo o log da concentração de sódio de zero a -1. Ajustar uma curva sigmoidal para a resposta. A partir da curva, calcular a concentração de sódio a α = 0,5, que representa a concentração na qual o sensor ideal responde. Ajustar a relação de CHIII, naix e NaTFPB na optode para criar nanosensores com ótima resposta em torno da concentração de sódio de interesse. 4. Imagem intracelular Para medições intracelular, o nanosensores são feitas em 5 de glicose mg / ml em água e microinjeção para as células. Crescer ou transferência de células para um prato fundo de vidro ou uma câmara de imagem com um fundo lamela de vidro. Incubar as células em meios de comunicação clara ou solução Tyrode é. Monte a câmara de imagem ou um prato em um microscópio de epifluorescência. Nós usamos uma Zeiss LSM 7 microscópio confocal. Puxe capilar de vidro com um puxador de pipeta. Nós usamos um Sutter flamejante marrom p-97 com 1 mm de diâmetro externo, 0,78 mm de diâmetro de vidro, com um diâmetro em torno de 300-500 ponta final nm. Reaterro da pipeta com a solução nanosensor usando uma seringa e uma agulha Hamilton, ou um carregador MICROTIP e uma pipeta. Monte a pipeta em um suporte que é acoplado a um micromanipulador e conectados a um sistema de injeção de pressão controlada. Aqui usamos um Burleigh EXFO micromanipulador 6000 PCS e uma médica sistemas corporação injector. Inferior a pipeta no topo da célula para o citoplasma e, às vezes é necessário "tocar" o titular do manipulador para perfurar a membrana. Injectar a solução nanosensor e rapidamente retirar a pipeta. 5. In vivo de imagens Todos os procedimentos foram revistos e aprovados pela Northeastern University de Cuidados Animal e Uso Comissão. Nanosensorespara in vivo, imagens extracelular são feitas em tampão fosfato salina e ajustado para ter uma resposta óptima de sódio em uma concentração de sódio de 135 mM. Para a injeção de configuração e imagem do nanosensores fluorescentes em camundongos, usamos o IVIS Lumina II e sua unidade de anestesia associada. Desinfectar a indução e câmaras de imagem. Lugar CD1 camundongos nude (aproximadamente 20g) na câmara de indução e expô-los a isoflurano. A porcentagem de vazão isoflurano e oxigênio administrado irá variar dependendo da espécie e peso de ratos. Aguarde os ratos para se tornar totalmente anestesiado. Depois de os ratos são anestesiados, remover os ratos da câmara de indução e coloque dentro da câmara de imagem. Manter os ratos sob anestesia. Para cada rato, desinfectar as áreas de injeção desejada. Encha uma seringa de insulina estéreis 31G com 10 mL de nanosensores certificando-se de remover todas as bolhas de ar. Utilizando uma pinça, segure uma pequena prega de pele ao longo das costas do mouse no local da injeção desejada. Ao segurar a pele, insira a seringa na pele com o bisel voltado para cima e agulha, paralelamente à pele. Antes de injetar os sensores, puxe o êmbolo da seringa para garantir a agulha não está inserido em um vaso sanguíneo. Então, gentilmente mover a agulha direita e esquerda para criar um bolso dentro da pele. Isso irá minimizar a pressão de volta que faz com que os sensores de vazamento para fora do local da injeção. Injetar os sensores e remova cuidadosamente a seringa. Aplique uma suave pressão no local da injecção e limpe qualquer solução que pode ter vazado para fora do local da injeção. Isso irá minimizar a fluorescência dos sensores que não são injetadas na pele. Repete as etapas 5,4 a 5.7 até que o número de áreas de injeção desejada seja atingida. Seis locais de injeção espaçados no lado esquerdo e direito das costas são recomendados. Para cada rato individual, a mudança de agulhas, se a agulha torna-se difícil inserir na pele. Agulhas não devem ser compartilhadas entre camundongos. Isso irá minimizar a transmissão da doença ou contaminação cruzada entre os ratos. Para geração de imagens dos sensores de sódio fluorescente, que adquirir imagens tanto claro e fluorescente dos camundongos usando conjuntos de filtros que mais se igualava os 640 nm/680 nm (excitação / emissão) espectro da nanosensores e que também minimizar a autofluorescência da pele. 6. Resultados representante Figura 1. Curvas de resposta de cinco diferentes conjuntos nanosensor ao sódio. Cada conjunto representa nanosensores a partir de formulações optode diferentes que tinham a mesma quantidade de CHIII, NaTFPB, PVC e DOS, mas quantidades variáveis ​​de naix. Os dados foram convertidos para valores α usando a intensidades 639/680 nm. Os dados são uma média de 3 barras, o erro omitidos para maior clareza, com uma curva sigmoidal equipado com Origin. Nesta curva de resposta, a concentração máxima de sódio utilizado foi de 500 mM. Kd o da nanosensores de sódio de sódio variou de 10 mM (diamantes laranja) para cerca de 150 mM (quadrados pretos). Figura 2. Injected neonatal miócitos cardíacos. As células foram cultivadas em lamínula, montado em um microscópio e injetados com nanosensores de sódio. Mostrados são fluorescentes (excitação nm 639), brightfield e sobreposição. Observe que alguns clusters de sensor ocorre, mas as células têm morfologia normal, sensores têm difundido em todo o citosol e não há nenhuma carga nuclear. Figura 3. Injeção subcutânea de camundongos com nanosensores de sódio. Nove injeções diferentes de nanosensores de sódio foram feitas para o espaço subcutâneo de ratos nude. Tanto o campo brilhante e imagens fluorescentes (640/680) são sobrepostas.