Dissecção do rim Zebrafish Adulto

1. Dissecção do rim zebrafish adultos a partir de uma amostra de animais unfixed Selecione um peixe-zebra adulto entre 3-6 meses de idade para dissecção. Euthanize o peixe, colocando-o em um prato com 0,2% tricaina pH 7,0 por cerca de 4-5 minutos, observando com cuidado para ver que as brânquias e parar de se mover o coração pára de bater. Usando uma colher, retire o peixe do banho tricaina em uma pequena quantidade de solução, decantar a solução e gentilmente colocar o animal em uma toalha de papel. Use uma tesoura afiada dissecção para remover a cabeça do animal, fazendo um corte logo atrás do opérculo branquial (Figura 1, Um caminho). Descartar a cabeça em um recipiente de resíduos de risco biológico. Use a tesoura de dissecção para abrir o corpo do animal, fazendo uma longa incisão ventral, a partir da cabeça e terminando na cauda, ​​na base da nadadeira caudal (Figura 1, B caminho). Remover os órgãos internos do animal usando um par de pinças de dissecção / forceps, e colocá-los no lixo de risco biológico. Tenha cuidado para não escovar a parede do corpo dorsal, pois este é o local do rim (Figura 2). Se você tiver selecionado um peixe fêmea, você terá de colher ovos em desenvolvimento fora da cavidade do corpo, que pode ser mais facilmente feito usando um par de pinças anguladas ou pinça. Use agulhas dissecção ao pino abrir as paredes do corpo a uma bandeja de dissecação, e ângulo os pinos para que o rim pode ser visualizado. O rim irá possuir uma forma característica (tronco, cabeça / cauda sela) e cor, sendo intercaladas com pigmentação em tons preto (Figura 2). Você também pode ver a aorta cheio de sangue periférico, que passa pela linha média da estrutura do órgão. Use uma pinça fina para separar o rim da parede dorsal do corpo, usando um par de fórceps para tirar o rim como você separa o órgão a partir do tecido conjuntivo que a fundamentam. Delicadamente, coloque o rim para o veículo desejado para posterior estudo de células vivas, tais como um tubo de microcentrífuga contendo PBS 1x para a preparação FACS. 2. Preparação e dissecção do rim zebrafish adultos a partir de uma amostra de animais fixos Prepare uma solução de 4% PBST paraformaldehyde/1X. Ferva a solução para dissolver o PFA em solução, então resfriar a mistura para 4 ° C e adicionar dimetilsulfóxido 0,1%. Tivemos o maior sucesso com a preservação do tecido do uso de soluções acabadas de fazer PFA em oposição a alíquotas congeladas. Faça solução suficiente para submergir o peixe-zebra adulto durante a dissecção. Encha uma bandeja de dissecação com solução de fixação suficiente para submergir o peixe-zebra adulto durante a dissecção. Nós execute as etapas subseqüentes com esta bandeja posicionada sob o microscópio, o que pode ser colocado em um capuz químico para minimizar a exposição ao odores fixação. Selecione um peixe-zebra adulto entre 3-6 meses de idade para dissecção. Euthanize o peixe, colocando-o em um prato com 0,2% tricaina pH 7,0 por cerca de cinco minutos, observando com cuidado para ver que as brânquias e coração parar de bater. Usando uma colher, retire o peixe do banho tricaina em uma pequena quantidade de solução, decantar a solução e gentilmente colocar o animal em uma toalha de papel. Use uma tesoura afiada dissecção para remover a cabeça do animal, fazendo um corte logo atrás do opérculo branquial (Figura 1, Um caminho). Descartar a cabeça em um recipiente de resíduos de risco biológico, e imediatamente colocar o animal na bandeja de dissecação PFA contendo. Use a tesoura de dissecção para abrir o corpo do animal, fazendo uma longa incisão ventral, a partir da cabeça e terminando na cauda, ​​na base da nadadeira caudal (Figura 1, B caminho), e manter o corpo parcialmente submerso durante o procedimento. Remover os órgãos internos do animal usando um par de pinças de dissecção / forceps, e colocá-los no lixo de risco biológico. Tenha cuidado para não escovar a parede do corpo dorsal, pois este é o local do rim (Figura 2). Use agulhas dissecção ao pino abrir as paredes do corpo, e os pinos ângulo de modo que o rim pode ser visualizado. O rim irá possuir uma forma característica (cabeça, sela, cauda) e cor, sendo intercaladas com pigmentação em tons preto (Figura 2). Você também pode ver a aorta cheio de sangue periférico, que passa pela linha média da estrutura do órgão. Fixar a amostra durante a noite, colocando a bandeja a 4 ° C, quando você é feito com amostras de organizar o desejado. No dia seguinte, retire a solução PFA da bandeja e substituir com 1x PBST. Use uma pinça fina para retirar cuidadosamente o rim da parede dorsal do corpo, usando um par de fórceps para tirar o rim como você separa o órgão a partir do tecido conjuntivo que a fundamentam. O tecido renal será macio e flexível do DMSO na solução fixadora, tornando possível para dissecar o órgão rim inteiro em uma única peça. Use um amplofuro pipeta de transferência para colocar o rim em um tubo de microcentrífuga. O rim pode agora ser processada posteriormente para realizar montagem histológica ou toda em estudos de expressão gênica situ com base no estudo desejado. 3. Resultados representativos: Os passos que estão diagramadas na Figura 1 indicam o procedimento de dissecção. O rim pode ser identificada com base na sua forma característica e coloração, e localização anatômica na parede dorsal da cavidade corporal do animal, como mostrado na Figura 2. Após a dissecção de um rim montagem amostra fixa, toda a hibridização in situ pode ser usado para localizar a expressão de um gene de interesse, como mostrado na Figura 3. Figura 1: Procedimento que permite o acesso direto para dissecar o rim adulto zebrafish. (A) zebrafish Euthanized é dissecado de forma gradual (indicados por números e setas) para dar ao pesquisador o acesso mais fácil ao órgão renal completa. Imagens da cavidade abdominal antes (B) e depois (C) a remoção dos órgãos abdominais. Figura 2:. Visualização do rim zebrafish em uma amostra unfixed Após a remoção de órgãos na cavidade do corpo, o rim aparece como um órgão único e achatado que é aderente à parede do corpo dorsal através de tecidos conjuntivos (A), e foi esquematizada (B) para mostrar a sua forma anatômica. Figura 3: mount inteiro em hibridizações in situ realizadas em todo o órgão adulto rim. (A) cadherin17 transcrições são detectados no túbulo de néfrons renais de adultos, ampliada em (A '). (B) transcrições mafba estão localizadas tipos néfron proximal de células no rim adulto (compare a túbulo inteira no painel A). (B' ) Uma visão ampliada de expressão mafba revela que as transcrições são especificamente localizada no podócitos (P), as células do sangue filtro (glomérulo) e túbulo contornado proximal (PCT).