Мы представляем метод хроматин иммунопреципитации из спинных ганглиев ткани корневой следующие аксонального травмы. Подход может быть использован для определения конкретных сайтов связывания транскрипционных факторов и эпигенетические модификации гистонов и ДНК важны для регенерации аксонов ранения в обоих периферической и центральной нервной системы.
Аксоны в центральной нервной системе (ЦНС) не восстанавливаются в то время как в периферической нервной системы (ПНС) не регенерировать в ограниченном объеме после травмы (Дэн и соавт., 2006). Следует признать, что транскрипционный программы необходимы для аксонов и аксонального результатом активизируются после травмы в ПНС (Makwana и соавт., 2005). Однако инструменты, доступные для анализа нейронной регуляции генов в естественных условиях ограничено и часто сложной задачей.
Спинных ганглиев корня (DRG) предлагают отличные модели системы травм, так как ЦНС и ПНС иннервируются раздвоенный аксон происходящей из той же сомы. Ганглии представляют собой дискретные коллекция клеточных тел, где все транскрипционные события происходят, и тем самым обеспечить четкое определение области транскрипционной активности, которые можно легко и воспроизводимо удалены от животного. Повреждение нервных волокон в ПНС (например, седалищного нерва), где аксонального регенерация происходит, должно выявить набор транскрипционных программы, отличные от тех, отвечая на аналогичный травмы в ЦНС, где регенерации не происходит (например, спинного мозга ). Участки для связывания транскрипционных факторов, гистонов и ДНК модификации в результате несчастного случая либо ПНС или ЦНС могут быть охарактеризованы с помощью хроматин иммунопреципитации (чип).
Здесь мы описываем ChIP протокол с использованием фиксированных тканей DRG мыши следующий аксонального травмы. Это мощное сочетание обеспечивает средства для характеристики про-хроматина регенерации среды, необходимой для продвижения аксонального регенерации.
Этот протокол обеспечивает метод прямо спросить о хроматина окружающую среду во время аксонального регенерации нервной системы взрослого следующие аксонального травмы. Она включает в себя модели DRG травмы с хроматином иммунопреципитации для исследования транскрипции и эпигенетиче?…
The authors have nothing to disclose.
Мы хотели бы поблагодарить Андреа Тедески за помощью в установлении первоначальных экспериментов чип в лабораторных и Рикко Lindner за вклад для тонкой настройки условий для чип. Эта работа была поддержана фондом Херти; Фортуна Грант, Университет Тюбингена, и DFG DI 1497/1-1 грантов (все предоставляемые Симоне ди Джованни).
Reagent | Company | Catalogue number |
---|---|---|
10x ChIP Buffer | Cell Signaling | 7008 |
2x ChIP Elution Buffer | Cell Signaling | 7009 |
ChIP Grade Protein G Magnetic Beads | Cell Signaling | 9006 |
Magna Grip Rack (8 well) | Millipore | 20-400 |
Chloroform | MERCK | UN 1888 |
37% Formaldehyde | ROTH | CP10.1 |
10x Glycine Solution | Cell Signaling | 7005 |
Glycogen | Sigma | G1767 |
10x HBSS | Gibco | 14185 |
Histone H3 antibody (rabbit) | Cell Signaling | 2650 |
Normal Rabbit IgG | Cell Signaling | 2729 |
Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol | ROTH | A156.1 |
Protease Inhibitors Cocktail Tablets | Roche | 04 693 116 001 |
Proteinase K (20 mg/ml) | Cell Signaling | 10012 |
SDS Lysis Buffer | Upstate | 20-163 |
Equipment needed |
---|
Sonicator |
Micropestle |
Microcentrifuge |
Thermomixer |