Evisceration of Mouse Vitreous and Retina for Proteomic Analyses

Jessica M. Skeie; Stephen H. Tsang; Vinit B. Mahajan

doi:10.3791/2795

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Biyoloji

Ausweiden der Maus Glaskörper und Netzhaut für Proteomik-Analysen

Published: April 03, 2011

doi:

10.3791/2795

Jessica M. Skeie^1,2, Stephen H. Tsang³, Vinit B. Mahajan^1,2

¹Omics Laboratory,University of Iowa, ²Ophthalmology and Visual Sciences,University of Iowa, ³Harkness Eye Institute,Columbia University College of Physicians and Surgeons

Özet

Die Dissektionstechnik zeigt Ausnehmen des Glaskörpers, der Netzhaut und Linse aus dem Auge der Maus, die Trennung durch Zentrifugation und Charakterisierung mit Protein-Assays.

Abstract

Während sich die Maus Netzhaut als ein wichtiges genetisches Modell für erbliche Netzhauterkrankung entstanden ist, bleibt die Maus Glaskörper, erkundet zu werden. Der Glaskörper ist eine sehr wässrige extrazellulären Matrix, die über der Netzhaut, wo intraokularen sowie extraokulären Proteine akkumulieren während der Erkrankung. ^1-3 Abnormal Interaktionen zwischen Glaskörper und Netzhaut zu Grunde liegen mehrere Krankheiten wie Netzhautablösung, proliferative diabetische Retinopathie, Uveitis und proliferative Vitreoretinopathie. ^{1 , 4} Die relative Maus Glaskörper Volumen ist deutlich kleiner als die menschliche Glaskörper (Abbildung 1), da die Maus Linse nimmt fast 75% seines Auges. ⁵ Diese hat biochemische Untersuchungen der Maus Glaskörper gemacht herausfordernd. In diesem Video-Artikel präsentieren wir eine Technik zu sezieren und zu isolieren, die Maus Glaskörpers von der Netzhaut, die ermöglichen die Verwendung von transgenen Mausmodellen, klarer zu definieren, welche Rolle dieser extrazellulären Matrix bei der Entwicklung von vitreoretinale Krankheiten werden.

Protocol

1. Anterior Segment Dissektion. Skleralgewebe hinter dem Limbus ist mit einem 0,22 ForceP und der ganzen Welt (Augapfel) stabilisiert wird erfasst. Eine mikrochirurgische Klinge wird verwendet, um eine lineare Schnitt in der Hornhaut von Limbus zu Limbus zu machen. Einer 0,12 Colibri ForceP wird dann verwendet, um die Hornhaut an den Einschnitt zu begreifen. Die Vorderkammer Flüssigkeit wird dann mit einer Weck-Cel chirurgischen Speer absorbiert. 2. Objektiv Ausnehmen. Einer 0,12 Colibri ForceP Greifen der Hornhaut wird verwendet, um den Globus zu stabilisieren. Eine feine gebogene Nadel-Halter (oder gebogenen Kornzange) ist hinter der Linse in Richtung der hinteren Seite des Globus eingesetzt. Der Nadelhalter ist teilweise geschlossen, und nach vorne gezogen. Druck ausgeübt wird, mit der Pinzette auf der äußeren Oberfläche der Sklera, der die Linse schiebt nach vorne durch die Hornhaut-Schnitt, während die Augen Wand intakt. Der Glaskörper wird als durchscheinende Gel und ist teilweise Anhänger der Linse. Das Objektiv-Glaskörpergewebe wird dann in einer gefilterten Zentrifugenröhrchen mit 20 Mikroliter Protease Inhibitor Cocktail (Roche) in PBS gelöst platziert. 3. Retina Ausnehmen. Weiter um den Globus mit 0,12 Colibri Pinzette greifen die Hornhautschnitt stabilisieren. Eine feine gebogene Nadel-Halter (oder gebogenen Kornzange) ist so weit hinter den Globus wie möglich platziert, in der Nähe des Sehnervs. Der Nadelhalter ist teilweise geschlossen, und nach vorne gezogen. Druck ausgeübt wird, mit der Pinzette auf der äußeren Oberfläche der Lederhaut, die die Netzhaut drängt nach vorne durch die Hornhaut-Schnitt. Der Glaskörper wird als durchscheinende Gel Anhänger der Netzhaut. Die Netzhaut wird visualisiert in Form eines gelben, vaskularisierten Gewebe. Jeder Streifen von pigmentierten Gewebe entfernt mit einer Pinzette abgezogen werden. Die Netzhaut-Glaskörper Gewebe wird dann in den gefilterten Zentrifugenröhrchen mit dem Objektiv-Glaskörpergewebe platziert. 4. Gefilterte Zentrifugation. Die gefilterte Zentrifugenglas wird in einer Tischzentrifuge gestellt. Spin bei 14.000 x G für 12 Minuten. Saugen Sie das Eluens aus der unteren Kammer, die den Glaskörper. Die Netzhaut bleibt in der oberen Kammer. Diese Proben können für Protein-Untersuchungen genutzt werden. 5. Repräsentative Ergebnisse Vitreous Proben wurden durch SDS-PAGE (Abbildung 2) analysiert. Die Proben wurden auch für eine enzymatische Aktivität Assay (Abbildung 3). Abbildung 1. Maus Augendiagramm. Querschnitts-Schema des humanen und Maus-Auge zeigt die relative kleinere Glaskörper Volumen in der Maus Auge aufgrund seiner größeren Objektiv. Abbildung 2. Eindimensionale SDS-PAGE von Maus Glaskörper und Netzhaut. Protein-Profile von Maus Glaskörper, 13,6 mg / mL (Bahn 1), und der Netzhaut, 11,35 mg / mL (Spur 2). Gel-Elektrophorese wurde bei 150 kV für 45 Minuten durchgeführt, gefärbt mit Flamingo fluoreszierende Gel färben und visualisiert mit Hilfe eines VersaDoc Imaging Systems (BioRad, Hercules, CA). Abbildung 3. Superoxiddismutase (SOD) Enzymaktivität in der Maus und Mensch Glaskörper. Messung von insgesamt SOD-Aktivität (SOD Aktivität kolorimetrischen aasay Kit, # AB65354, Abcam, Inc, Cambridge, MA) wurde am Glaskörper und Netzhaut durch das Ausnehmen von DBA und Albino-Mäusen gesammelt wurden. Dies wurde SOD-Aktivität in menschlichen Glaskörper Kern und menschliche Netzhaut aus post-mortem menschlichen Spender Augen gesammelt, um die relative Aktivität zu bestimmen. Das unverwässerte Glaskörper Kernproben wurden manuell abgesaugt mit einer 23-Gauge-Nadel, 11 und Netzhaut war von blühenden das Auge und Schneiden des Gewebes entfernt von der RPE / Aderhaut-Komplex gesammelt. Obwohl der Test nicht zwischen SOD-Isoformen unterscheiden, wird der Glaskörper SOD-Aktivität wahrscheinlich SOD3 reflektieren, da sie die einzige extrazelluläre Isoform ist 12 Die Netzhaut SOD-Aktivität wird wahrscheinlich alle drei SOD-Isoformen spiegeln:. Intrazellulären SOD1, mitochondriale SOD2 und extrazellulären SOD3. 12 Für hochsensible enzymatischen Assays, einschließlich dieser SOD-Assay wird die Möglichkeit einer Kreuzkontamination von Proteinen möglich und bedarf weiterer Untersuchung. Fehlerbalken stellen SEM.

Discussion

Transgene Mäuse sind ein wichtiges Modell für die Untersuchung der Netzhaut und Glaskörper Krankheit. ^6-10 Die Maus Glaskörper, umfasst jedoch einen deutlich kleineren Anteil des Auges im Vergleich zu den menschlichen Glaskörper aufgrund der großen Linse in der Maus Auge. ⁵ Diese macht es schwierig zu isolieren und zu reinigen der Maus Glaskörper. Das Verständnis der Protein-Veränderungen mit den Glaskörper bei Krankheiten wie proliferative diabetische Retinopathie, altersbedingte Makula-Degeneration, Uveitis und Netzhautablösung assoziiert wird Einblick in die Mechanismen geben, durch die sie Fortschritte. Diese visualisiert experimentelle Protokoll bietet die Möglichkeit zu erhalten und zu reinigen der Maus Glaskörper, bei gleichzeitiger Maximierung der Ausbeute an Protein für die enzymatische und Proteom-Analysen.

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Finanzierung wurde von Fight for Sight und Forschung zur Erblindung zu verhindern.

Materials

Name	Company	Catalog Number
15°, BD Beaver Microsurgical Blade	Becton-Dickinson	374881
PBS, pH 7.4	Invitrogen	70011-044
0.22 Fine-Castroviejo Suturing Forceps	Storz Ophthalmics	E1805
0.12 Colibri forceps	Storz Ophthalmics	2/132
Microcon Centrifugal Filter Ultracel YM-100 or YM-50	Millipore	42412, 42415
SOD Activity Colorimetric Assay Kit	Abcam	Ab65354
Weck-Cel surgical spears	Medtronic	0008680
Protease inhibitor cocktail	Roche	11 836 170 001
Flamingo fluorescent gel stain	Bio-Rad	161-04910

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Etiketler

Evisceration Mouse Vitreous Retina Proteomic Analyses Genetic Model Inherited Retinal Disease Aqueous Extracellular Matrix Intraocular Proteins Extraocular Proteins Retinal Detachment Proliferative Diabetic Retinopathy Uveitis Proliferative Vitreoretinopathy Mouse Vitreous Volume Biochemical Studies Dissect And Isolate Transgenic Mouse Models Extracellular Matrix Development Vitreoretinal Diseases

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Skeie, J. M., Tsang, S. H., Mahajan, V. B. Evisceration of Mouse Vitreous and Retina for Proteomic Analyses. J. Vis. Exp. (50), e2795, doi:10.3791/2795 (2011).