眼内容剜除小鼠玻璃体和视网膜蛋白质组分析

1。眼前段解剖。 角膜缘后巩膜组织掌握0.22 forcep和全球（眼球）是稳定的。 一个显微刀片是用来在从角膜缘角膜缘的角膜线性切口。 然后用0.12科利柏forcep把握角膜切口。 前房液，然后吸收与Weck – CEL手术矛。 2。镜头剜。 0.12科利柏forcep抓角膜用于稳定全球。 一个良好的弯针持有人（或弯曲敷料钳）插入后面的镜头走向全球的后路方面。持针器是局部封闭，并向前拉。巩膜，推动通过角膜切口的镜头而离开眼球壁的完整性的外部表面上使用镊子施加压力。玻璃体出现一个半透明的凝胶，部分附着在镜头上。 镜头玻璃体组织，然后放入含有20微升PBS溶解蛋白酶抑制剂的鸡尾酒（罗氏）一个过滤离心管。 3。视网膜剜。 继续稳定与0.12科利柏抓角膜切口钳全球。 一个良好的弯针持有人（或弯曲敷料钳）是放在全球尽可能远后，附近的视神经。持针器是局部封闭，并向前拉。巩膜，视网膜推动通过角膜切口的外部表面上使用镊子施加压力。作为一个半透明的凝胶，附着于视网膜玻璃体出现。视网膜是为黄色，吻合血管的组织的可视化。色素组织的任何条可用镊子剥离。 玻璃体视网膜组织，然后放入过滤离心机包含镜头玻璃体组织管。 4。过滤的离心。 过滤离心管放置在台式离心机。 14000 X克分拆为12分钟。 从下腔，这是玻璃体吸洗脱。视网膜仍然在上议院。这些样本可以用于蛋白质研究。 5。代表性的成果经SDS – PAGE（图2）玻璃体样本进行了分析。样品也被用于酶活性测定（图3）。 图1。老鼠眼图。横断面示意图显示了人类和小鼠的眼睛中由于其较大的镜头鼠标眼睛玻璃体体积相对较小。 图2一维的SDS – PAGE鼠标玻璃体和视网膜。鼠标玻璃体蛋白质图谱，13.6毫克/毫升（1巷），和视网膜，11.35毫克/毫升（2巷）。凝胶电泳在150千伏为45分钟，使用Flamingo荧光凝胶染色的染色和可视化使用VersaDoc成像系统（BioRad公司，大力士，CA）。 图3。超氧化物歧化酶（SOD）酶的活性在小鼠和人的玻璃体 。剜DBA和白化小鼠收集的玻璃体和视网膜上执行测量总SOD活性（SOD活性比色法aasay套件，＃AB65354，Abcam公司，公司，剑桥，马萨诸塞）。这是相比，在人类玻璃体核心和人类从验尸报告的人类捐助眼睛的视网膜收集到的确定的相对活性SOD活性。手动吸气，用一个23号针头，11日和开花的眼睛和切割组织，远离复杂的RPE /脉络膜视网膜收集，未经稀释的玻璃体核心样品。虽然检测不区分超氧化物歧化酶异构体，玻璃体SOD活性很可能反映SOD3，因为它是唯一的外亚型 12视网膜SOD活性很可能反映了所有三个超氧化物歧化酶亚型：是细胞内的SOD1，线粒体SOD2 ，外12 SOD3。高度敏感的酶检测，包括这种检测SOD，蛋白质的交叉污染的可能性是可能的，需要进一步研究。误差棒代表教统局局长。