엘루시브 작은 포유류의 고품질 DNA를 얻기 위해 비침 투 헤어 샘플링 기법

1. 헤어 스내어 전에 올무를 설정하는 이상적인 위치는 피카의 서식지 또는 탈루스 슬로프 내에서 결정되어야한다. 이것은 동물이 늦은 여름뿐만 아니라 변소 사이트에서 찾은 신선한 scats에서 수집하는 식물 캐시 아르 헤이 더미가 포함되어 있습니다. 포장 테이프 (길이 10~50cm)의 스트립은 360 ° 끈끈한 표면을 제공하기 위해 올리고 있으며, 봉투 피카의 건초 더미 (그림 1) 또는 변소 사이트의 입구를 웹 같은 방식으로 정렬됩니다. 바위의 구성에 따라 낚싯줄의 조각은 머리 함정의 구조를 지원하는 데 사용하지만,이 출입구의 사용에 대한 자세한 설명 (직경 <30cm) 매우 작은 경우 종종 필요하지 않습니다 수 있습니다 낚싯줄은 헨리와 Russello (2010) 3에서 찾을 수 있습니다. 헤어 스네어스은 가능한 한 자주 확인하고, 머리카락 샘플은 테이프 (그림 2)에 쌓인 거죠 것은 다음 수집하고 표시합니다. 일단 다시 실험실로 이송, 머리카락이 추가 조작까지 살균 집게를 사용하여 끈적끈적한 테이프에서 제거 및 극저온 튜브로 전송하고 -20 ° C에 저장됩니다. 독립적으로 클러스터 샘플이 다른 개인에 속하는 가정하는 동안 머리 올무 함께 모여 헤어 샘플은 하나의 개인에 속하는 것으로 간주됩니다. 후자의 경우에는 머리를 그런 다음 다른 튜브에 배치됩니다. 이러한 가정은 나중에 microsatellite genotypic 데이터에 기반한 DNA 지문과 정체성의 확률의 계산 방법으로 테스트할 수 있습니다. 2. DNA 추출 피카 머리가 매우 얇은하고 작은 루트 전구가 포함되어 있기 때문에, 우리는 이전에 25 머리카락의 최소 양질의 하류 PCR 증폭 3 DNA의 충분한 양을 얻기 위해 필요한 것으로 나타났습니다. 우리는 DNA IQ 시스템 (Promega, 매디슨, WI, 미국)와 머리카락 샘플에서 DNA 격리를 위해 제조 업체의 지침의 약간 수정된 버전을 사용. 첫째, 머리 샘플은 튜브를 여는 동안 머리의 손실을 방지하기 위해 마이크로 원심 분리기에서 다운 소용됩니다. 다음 부화 솔루션은 Proteinase K. 보육의 0.1 M DTT와 1.8ng/ml의 최종 농도 결과 DTT의 10μl (1M) 및 Proteinase K (18ng/ml)의 10μl와 부화 솔루션의 80 μl를 혼합하여 준비 솔루션 (100 μl) 시료에 추가 ° C 1 시간 56 incubated입니다. 그 동안에 용해 용액은 0.01M의 최종 DTT 농도의 결과로, 용해 버퍼의 모든 100 μl에 대한 DTT (1M) 1 μl를 추가하여 준비가되어 있습니다. 준비 용해 용액 (200 μl)는 다음 DNA IQ 수지 7 μl와 함께, 샘플에 추가 고속 3 초 동안 vortexed 5 분 실온에서 incubated입니다. 예제는 다음 2 초 vortexed 및 솔루션에서 자성 비즈의 분리가 발생 마그네틱 스탠드에 삽입됩니다. 나머지 솔루션은 다음 aspirated 및 폐기, 자기 수지의 펠렛을 방해하지 않도록주의하고 있습니다. 예제는 다음 준비 용해 솔루션 vortexed 및 분리가 다시 발생 마그네틱 스탠드에 반환의 100 μl로 처리됩니다. 용해 버퍼 aspirated과 폐기하고,이 단계는 세척 버퍼 (100 μl)를 사용하여 세 번 반복입니다. 예제는 이후 15 분 동안 자기 스탠드에서 건조 남아 있습니다. 일단 건조, 용출 버퍼 100 μl가 샘플에 추가되고 ° C 5 분 65 incubated. 예제는 vortexed 및 자기 스탠드에 삽입됩니다. 지금 eluted DNA를 포함하는 솔루션은 다음 1.5 ML Eppendorf 튜브에 전송하여 추가로 조작 때까지 -20 ° C에 저장됩니다. 간 샘플에서 DNA도 DNA의 IQ 시스템을 사용하여 추출 및 PCR의 amplifications에 대한 긍정적인 제어로 사용되었다. 3. PCR 증폭 우리 비침 투 헤어 올무와 간 샘플에서 얻은 DNA를 그 다음 일반적으로 사용되는 분자 마커 (microsatellite, AFLP, mitochondrial 시토크롬 B와 ZFX / ZFY sexing 표시)의 제품군을 증폭하는 데 사용되었습니다. – 20 NG의 DNA, 각 프라이머의 0.5 μm의, 10 MM 트리스 – HCL (산도 8.3), 50 MM 10 : PCRs가 포함된 25 μL 볼륨 Veriti 열 자전거 타는 사람을 (응용 Biosystems, 포스터 시티, CA, 미국)를 사용하여 수행되었습니다 KCl, 1.5 MM MgCl 2, 200 μm의 dNTPs, 10 μ 소 혈청 알부민 (BSA, 뉴 잉글랜드 Biolabs, 입스 위치, MA, 미국)와 0.5 U AmpliTaq 골드의 DNA 중합 효소 (응용 Biosystems). microsatellite loci를위한 자전거 매개 변수는 터치다운으로 자전거 프로그램 (95시 10 분 사용 최적화되었습니다 ° C, 95 ° 30 S에 대한 C, 30 S는 어닐링 35주기, 72 45의 ° C, 72에서 마지막 단계 다음 ° C 10 분). 1 감소 어닐링 온도 60 ° C에서 55 ° C 사이클 당 29주기 나머지 55에서 계속하는 시점에서 여섯 번째 사이클, ° C.에 도달하기 전까지는 mitochondrial 조각 자전거 매개 변수는 위에서 설명한 것처럼하지만, 소둔 35 사이클로 구성되었습니다50 ° C의 온도 증폭 단편 길이 다형성은 보닌 사에 의해 설명 척추 genomes에 대해 다음과 같은 프로토콜을 실시했다. 마지막으로, 분자 sexing는 HinfI 제한 효소 분해 5 ZFX / ZFY loci의 PCR – RFLP를 사용하여 실시되었다. 소화 ZFX / ZFX 조각이 들어있는 3 % 아가로 오스 겔에 100 BP의 사다리 (뉴잉글랜드 Biolabs)와 함께 실행하는 동안 microsatellite, AFLPs 및 시토크롬 B 시퀀스에서 PCR 제품은, ABI 3130XL 유전자 분석기 (응용 Biosystems)로 실행되었습니다 2.5 %의 SYBR 안전 DNA 젤 얼룩 (Invitrogen, 칼스 배드, CA, 미국)와 RED 개인 젤 이미징 시스템 (알파 Innotech, 샌 리앤드로, CA, 미국)을 사용하여 시각. Microsatellite 및 AFLPs은 Genemapper v3.7 (응용 Biosystems)와 mitochondrial DNA의 크로마토 그램을 사용하면 Sequencher v4.7을 (진 코드 공사 앤 하버, MI, 미국)를 사용하여 시각되었습니다 시각되었습니다. 4. 대표 결과 우리 비침 투 올무를 사용하여 얻은 머리카락 샘플에서 추출한 DNA가 PCR은 분자 마커의 다양한 유형을 증폭하는 데 사용되었습니다. 비교를위한 기초로, DNA가 간 샘플은 우리의 머리카락 샘플과 함께 증폭되었습니다 사용하여 추출. 핵 microsatellite loci의가 성공적으로 머리와 간 샘플 (그림 3) 모두 증폭되었다. 간 샘플을 사용할 때 신호의 강도가 큰했지만,이 유전자형 점수에 부정적인 영향 (그림 3)가 없었어요. AFLPs (그림 4), mitochondrial DNA 시퀀스 (그림 5)와 ZFX / ZFY 분자 sexing 표시 (그림 6)를 사용하면 비슷한 결과가 달성되었습니다. 그림 1. 비침 투 머리 올무의 예제는 건초 더미에서 설정할 수 있습니다. 올리고 분명히 포장 테이프의 스트립은 건초 더미로 입구를 묶으하는 웹 같은 방식으로 정렬됩니다. 낚싯줄의 조각은 머리 함정에 대한 추가 지원을 제공하기 위해 여기에 사용됩니다. 그림 2. 패킹 테이프에 붙어있는 머리카락의 다수를 포함하는 성공적인 헤어 올가미. 그림 3. 대표적인 핵 microsatellite의 크로마토 그램 (Ocp6) 8로 Genemapper v3.7 (응용 Biosystems)에 표시됩니다. 상단 크로마토 그램은 간 조직에서 DNA 증폭에 의해 얻은,이 로커스에서 (358분의 354) heterozygous가되었습니다. 하단 크로마토 그램은 머리카락에서 추출한 DNA를 기반​​으로 heterozygous 유전자형 (362분의 358)를 전시 다른 개인을 나타냅니다. 머리 샘플에서 크로마토 그램의 신호가 간 샘플보다 낮은 강도를 가지고 있지만, 유전자형 점수는 부정적인 신호의 차이에 의해 영향을받지 않습니다. 그림 4.로서 Genemapper v3.7 (응용 Biosystems)에 표시 대표 AFLP의 크로마토 그램 (E31T32). 상단 크로마토 그램은 간 조직에서 DNA 증폭에 의해 얻은, 하단 크로마토 그램은 머리카락에서 뽑아낸 DNA를 나타냅니다. 그림 5.로서 Sequencher v4.7 (진 코드 주식 회사)에 표시 mitochondrial DNA 대표 시퀀스 크로마토 그램 (시토크롬 B). 상단 크로마토 그램은 간 조직에서 DNA 증폭에 의해 얻은, 하단 크로마토 그램은 머리카락에서 뽑아낸 DNA를 나타냅니다. 그림 6. 간 및 헤어 샘플 모두 증폭 대표 분자 sexing 마커 (ZFX / ZFY). 이러한 접근 방식은 Y의 염색체가 X 염색체의가 결여되는이 지역의 HinfI 제한 사이트를 보유하고있는 관측에 의존합니다. 수컷 432 BP, BP 261 및 171 BP의 조각을 제작하는 동안 따라서, 여성은 432 BP의 두 공동 이주 조각을 생산하고 있습니다.