Ein nicht-invasives Haar Sampling-Technik, um High Quality DNA aus Elusive Kleinsäuger erhalten

1. Haare Snare Vor dem Einrichten einer Schlinge, hat eine ideale Lage innerhalb des pika Lebensraum oder Geröllhalde bestimmt werden. Dazu gehören Heuhaufen, die Vegetation Caches, die Tiere zu sammeln im Spätsommer sowie frische scats bei Latrine Websites zu finden sind. Streifen aus Klebeband (10-50cm Länge) sind bis zu einer 360 °-klebrige Oberfläche bieten gerollt und sind in einem Web-Manier zum Umschlag der Eingang zum pika ist Heu Stapel (Abb. 1) oder Latrine Seite angeordnet. Abhängig von der Konfiguration der Felsen, kann ein Stück Angelschnur verwendet werden, um die Struktur des Haares Schlinge zu unterstützen, aber das ist oft nicht nötig, wenn Eingänge recht klein (<30cm im Durchmesser) sind, eine vollständige Beschreibung des Einsatzes von Angelschnur in Henry und Russello (2010) 3 gefunden werden. Haare Fallen sind so oft wie möglich geprüft und Haarproben abgeschieden auf dem Band (Abb. 2) werden dann gesammelt und beschriftet. Sobald transportiert zurück ins Labor werden die Haare aus dem Klebeband mit einer sterilen Pinzette entnommen und in Kryoröhrchen und bei -20 ° C bis auf weiteres Manipulation. Haarproben gemeinsam auf ein Haar Snare Cluster werden als ein einzelnes Individuum gehören, während die Proben Cluster unabhängig davon ausgegangen werden, um verschiedene Individuen angehören. Im letzteren Fall ist das Haar dann in verschiedene Röhrchen. Diese Annahmen können später mittels DNA-Fingerprints und Berechnungen der Wahrscheinlichkeit von Identität auf Mikrosatelliten genotypischen Daten getestet werden. 2. DNA-Extraktion Da pika Haar ist sehr dünn und enthält eine winzige Wurzel Glühbirne, haben wir bereits gezeigt, dass ein Minimum von 25 Haare notwendig sind, um ausreichende Mengen an DNA für eine gute Qualität nachgeschalteten PCR-Amplifikation 3 zu erhalten. Wir verwendeten die DNA IQ-System (Promega, Madison, WI, USA) und eine leicht modifizierte Version des Herstellers für DNA-Isolierung aus Haarproben. Erstens ist die Haarprobe in einem Mikro-Zentrifuge geschleudert, um Haarausfall zu vermeiden, während dem Öffnen der Tube. Dann wird die Inkubation Lösung wird durch Mischen von 80 ul der Inkubationslösung mit 10 &mgr; l von DTT (1M) und 10 &mgr; l von Proteinase K (18ng/ml) in einer Endkonzentration von 0,1 M DTT und 1.8ng/ml von Proteinase K. Incubation Ergebnis vorbereitet Lösung (100 ul) wird auf die Probe zugegeben und bei 56 ° C für 1 Stunde. In der Zwischenzeit ist die Lyse-Lösung durch Zugabe von 1 ul der DTT (1M) für jeweils 100 ul Lysepuffer, was zu einer endgültigen DTT Konzentration von 0,01 M vorbereitet. Vorbereitet Lyse-Lösung (200 ul) wird dann auf die Probe gegeben, zusammen mit 7 ul der DNA IQ Harz, gevortext für 3 Sekunden bei hoher Geschwindigkeit und bei Raumtemperatur inkubiert für 5 Minuten. Die Probe wird dann für 2 Sekunden gevortext und in die magnetische Halterung, wo die Trennung von magnetischen Kügelchen aus der Lösung auftritt. Die verbleibende Lösung wird dann abgesaugt und verworfen, darauf achten, daß das Pellet aus magnetischen Harz zu stören. Die Probe wird dann mit 100 ul der vorbereiteten Lyse-Lösung gevortext und wieder in die magnetische Halterung, wo die Trennung erfolgt wieder behandelt. Der Lysepuffer wird abgesaugt und verworfen, und dieser Schritt wird dreimal wiederholt mit einem Waschpuffer (100 ul). Die Probe wird anschließend links in die magnetische Halterung für 15 Minuten trocknen lassen. Nach dem Trocknen ist 100 ul Elutionspuffer auf die Probe zugegeben und bei 65 ° C für 5 Minuten. Die Probe wird verwirbelt und in die magnetische Halterung. Die Lösung enthält jetzt die eluierte DNA wird dann in einem 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen überführt und bei -20 ° C bis auf weiteres Manipulationen. DNA aus der Leber Proben wurde ebenfalls extrahiert mit der DNA IQ-System und als positive Kontrolle für die PCR-Amplifikationen. 3. PCR-Amplifikation Die DNA aus unserer nichtinvasiven Haar Snare und die Leber erhaltenen Proben wurden dann verwendet, um eine Reihe von häufig verwendeten molekularen Marker (Mikrosatelliten, AFLP, mitochondrialen Cytochrom B und ZFX / ZFY Geschlechtsbestimmung Marker) zu verstärken. PCRs wurden mit einem Veriti Thermocycler (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) in einem 25 ul Volumen enthält: 10 bis 20 ng DNA, 0,5 uM von jedem Primer, 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl 2, 200 uM dNTPs, 10 μ Rinderserumalbumin (BSA; New England Biolabs, Ipswich, MA, USA) und 0,5 U AmpliTaq Gold DNA-Polymerase (Applied Biosystems). Radfahren Parameter für den Mikrosatelliten-Loci wurden optimiert mit einem Touchdown PCR-Programm (10 min bei 95 ° C, 35 Zyklen bei 95 ° C für 30 s, 30 s Annealing und 45 s bei 72 ° C, durch einen letzten Schritt bei 72 ° C für 10 min). Die Annealingtemperatur um 1 verringert ° C pro Zyklus von 60 bis 55 ° C bis zum Erreichen des sechsten Zyklus, an welcher Stelle der 29 verbleibenden Zyklen bei 55 ° C. Radfahren Parameter für die mitochondriale Fragmente wurden wie oben beschrieben, aber bestand aus 35 Zyklen mit einer Glüh-Temperatur von 50 ° C. Amplified Fragment Length Polymorphism wurde nach dem Protokoll für Wirbeltier-Genomen von Bonin 4 beschrieben durchgeführt. Schließlich wurde molekularen Geschlechtsbestimmung durchgeführt unter Verwendung des PCR-RFLP von ZFX / ZFY loci mit HinfI Restriktionsenzymverdau 5. Die PCR-Produkte aus der Mikrosatelliten, AFLPs und Cytochrom B-Sequenzen wurden auf einem ABI 3130xl Genetic Analyzer (Applied Biosystems) laufen, während verdaut ZFX / ZFX Fragmente neben einem 100 bp Leiter (New England Biolabs) auf einem 3% Agarosegel mit ausgeführt wurden 2,5% SYBR Sicherer DNA-Gel-Färbung (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) und visualisiert mit einer RED persönlichen Gel Imaging System (Alpha Innotech, San Leandro, CA, USA). Mikrosatelliten und AFLPs wurden mittels GeneMapper v3.7 (Applied Biosystems) und die mitochondriale DNA Chromatogramm wurde unter Verwendung Sequencher v4.7 (Gene Codes Corporation, Ann Harbour, MI, USA). 4. Repräsentative Ergebnisse Die DNA aus Haarproben unter Verwendung unserer nichtinvasiven Snare extrahiert wurden verwendet, um PCR zu amplifizieren verschiedenen Typen von molekularen Markern. Als Grundlage für den Vergleich, extrahierten DNA mit Leberproben neben unseren Haarproben wurde verstärkt. Nuclear Mikrosatelliten-Loci wurden erfolgreich sowohl für Haare und Leber-Proben (Abb. 3) verstärkt. Obwohl die Intensität des Signals war größer, wenn Sie die Leberproben, tat dies keinen negativen Einfluss auf Genotyp Scoring (Abb. 3). Ähnliche Ergebnisse wurden erzielt, wenn AFLPs (Abb. 4), mitochondriale DNA-Sequenzen (Abb. 5), und der ZFX / ZFY molekularen Geschlechtsbestimmung Marker (Abb. 6). Abbildung 1. Ein Beispiel für eine nicht-invasive Haar Snare eingerichtet in einem Heu Stapel. Strips von aufgerollt klar Klebeband sind in einem Web-artig an den Eingang, um das Heu Stapel legen angeordnet. Ein Stück Angelschnur ist hier, um zusätzliche Unterstützung für die Haare Snare bereitzustellen. Abbildung 2. Eine erfolgreiche Haar Schlinge mit einer großen Anzahl von Haaren klebte an das Klebeband. Abbildung 3. Ein Vertreter nuklearen Mikrosatelliten-Chromatogramm (Ocp6) 8 als in GeneMapper v3.7 (Applied Biosystems) angezeigt. Die obere Chromatogramm wurde durch Amplifikation von DNA aus Lebergewebe gewonnen und ist heterozygot (354/358) an diesem Locus. Die untere Chromatogramm repräsentiert eine andere Person ausstellen einem heterozygoten Genotyp (358/362) auf die DNA aus Haaren extrahiert wurden. Während das Signal des Chromatogramms aus der Haarprobe hat eine geringere Intensität als die Leber Probe wird Genotyp Scoring nicht durch diesen Unterschied im Signal betroffen. Abbildung 4. Ein Vertreter AFLP Chromatogramm (E31T32) als in GeneMapper v3.7 (Applied Biosystems) angezeigt. Die obere Chromatogramm durch Amplifikation von DNA aus Lebergewebe gewonnen wurde, stellt die untere Chromatogramm der DNA aus Haaren extrahiert. Abbildung 5. Ein Vertreter mitochondriale DNA-Sequenz-Chromatogramm (Cytochrom B) wie in Sequencher v4.7 (Gene Codes Corporation) angezeigt. Die obere Chromatogramm durch Amplifikation von DNA aus Lebergewebe gewonnen wurde, stellt die untere Chromatogramm der DNA aus Haaren extrahiert. Abbildung 6. Ein Vertreter molekularen Geschlechtsbestimmung Marker (ZFX / ZFY) sowohl für Leber-und Haarproben verstärkt. Dieser Ansatz beruht auf der Beobachtung, dass die Y Chromosom ein HinfI Restriktionsschnittstelle in dieser Region, dem X-Chromosom fehlt besitzt. So produzieren Weibchen zwei Co-Migration Fragmente von 432 bp, während männliche Fragmente von 432 bp, 261 bp und 171 bp produzieren.