쥐의 간 세포의 주요 문화 macrophages를 얻을 소설 방법을 설명합니다. 이 방법은 플라스틱 요리 선택적 첨부하여 문화 flasks 및 정화의 흔들림 다음 문화 macrophages의 확산을 활용합니다. 이 기술은 효율적으로 복잡한 장비와 기술없이 간 macrophages을 제공합니다.
Kupffer 세포가 간 특정 주민 macrophages이며, 1-3 간의 생리와 병리 학적 기능에 중요한 역할을한다. 간 macrophages의 절연 방법 4-6 잘 설명하고 있지만, 이러한 방법의 대부분은 이러한 원심 elutriator 및 기술 능력 등 정교한 장비가 필요합니다. 여기, 우리는 간략하게 구조 그림 1에 설명된 성인 쥐의 간 세포의 혼합 차 문화에서 충분한 번호 및 순도에 간 macrophages을 얻기 위해 소설 방법을 제공합니다.
2 단계 재관류 방법 7,8하여 간 세포의 분리 후, 대부분 parenchymal hepatocytes 구성된 분수가 준비하고 DMEM와 10 %의 FCS.Parenchymal hepatocytes 구성된 문화 매체와 T75 조직 문화 flasks에 씨앗을 품고 것은 상피 세포의 형태를 잃게 문화의 몇 일 이내에, 타락한 또는 fibroblast 같은 세포 (그림 2)로 변환. 로 문화의 날 6 주위 진행, 위상 대조 – 밝고 둥근 대식 세포와 같은 세포 (그림 2) fibroblastic 세포 시트에 분아 따위에 의해 번식을 시작합니다. 대식 세포와 같은 세포의 성장은 술병의 표면에있는 세포 시트를 덮고, 계속 일 1,200 최대 수준에 도달. 문화 flasks의 흔들림으로, macrophages는 즉시 문화 매체로 중단됩니다. 와 같은 다른 오염 세포가 정지 상태 macrophages의 선택 접착에 플라스틱 접시 결과의 후속 전송 및 짧은 부화 (그림 3). PBS 여러 rinses 후, 첨부된 macrophages은 수확하고 있습니다. 이상 10 6 세포는 두 개 이상의 주 (그림 3) 2-3일 간격으로 동일한 T75 조직 문화 플라스크에서 반복적으로 수확 수 있습니다.하거나 유동세포계측법에 의해 평가로 격리 macrophages의 purities은 95~99%되었습니다 쥐 대식 세포 특정 항체 (그림 4)와 immunocytochemistry가. 고립된 세포는 LPS로 자극하고, 형성시 polystylene 비즈의 적극적인 phagocytosis (그림 5), 재조합 GM – CSF에 proliferative 반응, 염증 / 안티 – 염증성 크린 시토킨의 분비를 보여 multinucleated 거대 세포 9.
결론적으로, 우리는 방법이 다른 포유 동물 종에 적용있을 복잡한 장비 및 skills.This없이 충분한 번호 및 순도에 간 macrophages를 얻을 수있는 간단하고 효율적인 방법을 제공합니다.
여기, 우리는 성인 쥐의 간 세포의 혼합 차 문화에서 macrophages를 얻을 간단하고 효율적인 방법을보고합니다. 우리의 방법은 쥐 간 세포의 혼합 문화 macrophages의 소설 proliferative 활동에 첫번째 의존하고 macrophages 9으로서의 생물 학적 특성을 바탕으로 이러한 세포의 후속 분리 및 정화. 그것은 성인 간 세포의 혼합 차 문화의 확산 macrophages는 Kupffer 또는 parenchymal hepatocytes 분율로 오염과 관련된 세포에서 유래있을 수도 있습니다. macrophages는 혼합 차 문화에 parenchymal hepatocyte 10 기타 fibroblastic 세포의 변화로 인해 특정 환경 변화에 대응 할 수도 있습니다.
결론적으로, 우리의 방법은 정교한 장비와 기술을 사용하여 쥐의 간 cellswithout의 주요 문화 충분한 번호 및 순도의 대식 세포와 같은 세포의 격리를 제공합니다. 또한, 절연 절차는 두 개 이상의 주 같은 문화 플라스크와 반복 수 있습니다. 이 방법은 다른 포유 동물 종에 적용할 수 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 연구 그랜트 그랜트 – – 에이드 일본의 농림 수산 장관의 식품 나노기술 프로젝트에서.에 의해 투자되었다
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
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Sodium pentobarbital solution | Kyoritsu Seiyaku | Somnopentyl Injection | |
Hank’s balanced salt solution (HBSS) | Invitrogen | 14185-052 | |
Ethylene glycol tetraacetic acid(EGTA) | Sigma-Aldrich | E-4378 | |
Collagenase | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 032-10534 | Cell dissociation grade (Lot check needed) |
Trypsin inhibitor | Sigma-Aldrich | T-9128 | |
Eagle’s minimum essential medium (MEM) | Sigma-Aldrich | M-4655 | |
Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM) |
Sigma-Aldrich | D-6459 | High glucose-type |
Fetal calf serum (FCS) | HyClone | SH30070.03 | Heat inactivated at 56°C for 30 min. (Lot check needed) |
TrypLE Express | Invitrogen | 12605 | |
Dulbecco’s phosphate buffered saline (PBS) | Invitrogen | 14190 | Ca2+-Mg2+ free |
β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M-7522 | Stock: 100 mM in distilled water |
Insulin | Sigma-Aldrich | I-5500 | Stock: 10 mg/ml in 0.1N HCl |
Penicillin/ streptomycin | Invitrogen | 15070 | |
Cell strainer | BD Biosciences | 352360 | Mesh size: 100 μm |
Tissue culture flask | Sumitomo Bakelite Co., Ltd. | MS-21250 | Surface area: 75 cm2 |
Non-tissue culture plastic dishes | BD Biosciences | 351005 | |
Cell scraper | Corning Inc. | 3010 | |
Reciprocal shaker | TAITEC | NR-1 |