Doğrudan Yetişkin Zebra balığı Böbrek Hücre Nakli

1. Transgenik olmayan alıcı balık klima. Transplantasyon için sistemin en büyük erkek balık seçin. Yaklaşık 3 dakika boyunca ya da yüzme, ama kalbim duracak gibi değil uzun durur kadar% 0.02 Tricaine balık (pH 7) yerleştirin. Anestezi balık tezgah üstüne nemli bir kağıt havlu üzerine koyun. Su 20 uL gentamisin 40 ug balık intraperitoneal boşluğuna enjekte etmek için bir insülin şırınga iğnesi kullanın. Böbrek yenileme çalışmaları için, bu adım için uygun bir ortam gelişmiş engraftman indükleyici için önemlidir. Balık kurtarma için sistem su içine geri koyun. Balık uysal ve titreşim gibi dış uyarana karşı çok duyarlı olabilir. Kurtarma 3 saat sonra, 25 gri gama ışınlama ile balık davranın. Nakli için önce gıda olmadan 3 gün boyunca balık sistem geri koyun. 2. Progenitör donör hücrelerinin hazırlanması genetik bir floresan işaretleyici (EGFP veya mCherry) ile etiketlenir. Sadece cerrahi işlem öncesinde, nakledilen donör hücreleri hazırlamak ve buz üzerinde saklayın. Böbrek ve hematopoietik progenitör hücreler içeren transgenik hattı, böbrek çalışmaları için Tg (EGFP cdh17) tüm böbrek iliği hücreleri kullanır. Bu progenitör hücrelerin genetik olarak etiketlenir ve renal epitel hücrelerin içine sokmak ve ayırt EGFP ifade edecektir. Angioblast atalarıdır nakli için: hematopoietik kök hücre veya Tg (EGFP fli1a): etiketli progenitör hücreler diğer türleri de Tg (EGFP SCL) gibi, kullanılan olabilir. 5 dakika boyunca% 0.2 Tricaine koyarak 3 yetişkin transgenik balık Euthanize. Ventral kenarı boyunca bir orta hat kesi yapmak için baş ve kuyruk ve diseksiyon makas kaldırmak için steril bir jilet kullanın. Stereoskop altında, cımbız ile kesesi de dahil olmak üzere vücut boşluğunda iç organların tümünü kaldırmak. Boşluğunun dorsal duvara bağlı bir düz ve pigmentli organ olan böbrek, kaldırmak için değil dikkatli olun. Sonra, dorsal duvarından böbrek incelemek ve 300 uL% 2 fetal buzağı serumu (1X PBS / 2% FCS) ile desteklenmiş soğuk fosfat tamponu salin içeren bir 1.5 mL santrifüj tüpü içine yerleştirin. Homojenize olana kadar kesme böbrek havaneli kullanın. 50 ml Falcon tüp içinde 40 UM hücre süzgeç yerleştirin ve gevşek hücreleri Falcon tüp içine süzülmeye sağlayan hücre süzgeç üstüne hücre çözümü transfer. Havaneli hafifçe smear, hücreleri daha yukarı kırmak için süzgeç sol büyük doku parçaları kullanın. Falcon tüp hücre çözümü bırakın ve süzgeç artık hücreleri toplamak için 1X PBS / 2% FCS 1.2 mL süzgeç yıkayın. 5 dakika boyunca 300 ° C RCF az 4 hücre çözümü yeni bir 1.5 mL tüp ve santrifüj içine aktarın. Hücre pelletini 1,5 mL 1X PBS / 2% FCS ile yıkayın ve yapışkan hücreleri kümeleri filtre ve tekrar santrifüj yeni bir süzgeç üzerinden geçmek. 1X PBS /% 2 FCS 200 uL hücre pelletini tekrar bir PCR tüpüne transfer. PCR tüp (4 ° C, 300 RCF, 1 dak.) Santrifüj ve süpernatant en çıkarmak. 2-5 uL son hacim ve buz üzerinde saklamak için artık süpernatant hücrelerin tekrar Nihai hücresel verimi böbrek başına yaklaşık 2 milyon hücre olmalıdır. Bir hemasitometre hücrelerinin sayısını ve 5 konsantrasyonu ayarlanarak uL ortalama x 10 5 hücre. 3. Hamilton enjektöre hücre çözümü yükleyin. Hamilton şırınga 3 kez steril su ile durulayın. 3 kez etanol% 75 ile şırınga durulayın. 1X PBS /% 2 FCS 3 kez ile tekrar şırınga durulayın. Sonra 1 uL hücre çözüm enjeksiyondan hemen önce yaklaşık 5 x 10 5 hücre içeren şırınga yükleyin. 4. Progenitör hücrelerin doğrudan böbrek transplantasyonu. Balık hareket durdu, yaklaşık 3 dakika kadar veya değil, çok uzun kalp durur yenerek% 0.02 Tricaine klimalı alıcı balık anestezisi. Bir stereomikroskop altında, nakledilen tarafı kapalı kurutmak üzere, sol, ventral tarafına doğru kafa ile bir kağıt havlu üzerine balık yatıyordu. Sonra, kurutulmuş yan maruz balık döndürün. Steril cımbız kullanarak, solungaçları hemen arka bölgedeki ölçekler çıkarın. Cımbız ile doku stabilize bir neşter ile orta hatta bu alanda bir 1 cm lateral insizyon olun. Yeterince derin kesi yapmak için devam ederken, cımbız kullanarak, doku maruzbaş böbrek ortaya çıkarmak için. Böbrek görselleştirme engeller çok fazla kanama varsa, balık euthenize ve başka bir alıcı balık baştan başlamak. Baş böbrek maruz doku açık meraklı iken, doğrudan başkanı böbrek hücreli çözüm 1 uL enjekte edilir. Sonra, doku enjekte edilen hücrelerin sızmasını önlemek için yerine geri döner, böylece aynı zamanda şırınga iğnesi alındığını, cımbız bırakın. Sürücü ve kesi her tarafında kas yoluyla delmek bir iğne ile dikiş iğnesi tutun. 2 knot Kravat ve aşırı sütür kesti. Sadece tek bir sütür 1 cm'lik kesi için gereklidir. Balık sakinleştirici bir analjezik etki sağlamak için 5 saat Tricaine bir milyon kişi başına 10 parça içeren balık suda balık yerleştirin. Balık, normal beslenmeye ile kurtarma için sistem geri yerleştirin. Iyileşme 7-18 gün sonra, biz balık incelemek ve böbrek progenitör hücrelerin canlı EGFP floresan engraftman analiz. 5. Temsilcisi Sonuçlar: Nakli genel strateji Şekil 1'de gösterilmiştir. Böbrek çalışmaları için, böbrek disseke ve EGFP floresan analiz. Aşı ve böbrek progenitör hücrelerin farklılaşması, yedi gün transplantasyon sonrası gibi erken olarak tespit edilmiştir. Bu EGFP birden çok küme + böbrek epitel hücreleri (Şekil 2) varlığı açıktır. Transplantasyon sonrası 18 gün, biz, donör hücreleri yeni böbrek dokusu oluşur (Şekil 3) olduğunu belirten bir ortalama 24 EGFP + nefron algılar. Uzun vadeli engraftman göstermek için, bir alıcı balık 59 gün transplantasyon sonrası disseke (Şekil 4). Bu balık böbrek progenitör hücrelerin göç olduğunu öne sürerek, uzak bölgelere (beyaz ok başları) birden fazla nefron ek olarak enjeksiyon yerinde (kırmızı ok ucu) birçok nefron vardı. Bu teknik hücreleri, engraftman algılamak için yaklaşık üç ay sürer kalp, üzerinden dolaşıma enjekte edilir göre daha hızlı ve daha verimli olur. Şekil 1. Nakli Sigara transgenik alıcı balık Genel düzeni nakledilen hücrelerin bağışıklık ret bastırmak için ışınlanmış. Üç gün sonra, balık ve donör progenitör hücrelerin kanadında bir kesi yapılır maruz kafa böbrek içine enjekte edilir. Kesi geri kurtarma için sistemin içine yerleştirilen bir dikiş ve balık ile kapalıdır. Daha sonraki zaman noktalarında alıcı balık Böbrekler disseke ve engraftman ve progenitör aktivitesi için analiz edilir. Şekil 2. Aşı yedi gün sonra progenitör hücrelerin. Böbrek progenitör hücrelerin Aşı EGFP + böbrek epitel hücreleri kümeleri varlığı (büyütülmüş görünümü içerlek) tarafından belirlenen, yedi gün transplantasyon sonrası baş böbrek enjekte edilen tarafta tespit edilmiştir . Şekil 3. 18 gün sonra progenitör hücrelerin Aşı transplantasyon sonrası 18 gün sonra, ortalama 24 EGFP + donör kaynaklı nefron (insert – bireysel EGFP + nefron büyütülmüş görüntüsü) algılamak. Şekil 4. 59 gün sonra Aşı ve progenitör hücrelerin göç, hatta 59 gün sonra (kırmızı ok başı), uzun progenitör hücrelerin naklinden sonra engraftman algılamak için devam etti . Bu daha sonraki zaman noktasında, donör kaynaklı nefron, progenitör hücre göçü ile tutarlı enjeksiyonu (beyaz ok başları) sitesi, uzakta siteleri tespit edilir.