干渉反射イメージングセンサー（IRIS）を用いた生体分子の検出

1。基板の準備コート層状シリコンのSiO自己吸着コポリ（DMA – NAS – MAPS）2基板： 共重合体の合成、化学構造、およびコーティングプロセスは、で公開されています：G. Pirri、F.達民、M.キアリ、E. Bontempi、LE Deperoを。 DNAマイクロアレイスライドガラス用高分子吸着コーティングの特性評価。アナル。化学。 2004年、76、1352から1358。 簡単に言うと、脱イオン（DI）水5 mLにポリマーの100 mgを追加することにより、ポリマー溶液を調製し、0.92 Mの最終濃度に達するために40％飽和硫酸アンモニウム（（NH 4）2SO 4）溶液5mlを追加シェーカーで30分間溶液中とその後水没のチップは、DI水ですすぐ。アルゴン/ N 2ガ ​​スで十分に乾燥させます。 80焼くチップ℃で15分間。 ストアポリマーで被覆したプローブのスポッティング手順まで、最大3ヶ月間乾燥した環境（真空デシケーター）における基板/チップ。 2。プローブアレイの作製：抗体、抗原、SS /二本鎖DNA、RNAなど目的のバッファで適切な濃度にプローブ（複数可）を希釈する。このステップはかなり変動することができますが、典型的な実験はpH≈7.4で緩衝生理食塩水（PBS）、リン酸で0.5 mg / mLの濃度（0.1 -1 mg / mLの範囲）で抗原またはIgGを使用しています。 または384ウェルプレート（または使用中のスポッターのための標準的なソースプレート） – 96の場所のソリューション希望のプリントされた配列のパラメータをスポッティングセットアップ：（回、アプローチ速度、等の滞留）使用されている面とソリューションのために適切なスポッティングのパラメータを決定する。グリッド、グリッドレイアウト、複製グリッドの数、およびチップ上の任意のスポットの位置ごとにそれぞれの条件の複製の数を決定します。適切な場所に配置基板とソースのプレートは、廃棄物と供給ボトルの準備ができたら、と印刷の実行を開始する確認してください。 スポッティングは、固定化および非アクティブ化プロセスの続行を許可する（4-18時間）、高湿度環境での場所の基質は一晩終了後。 基板を洗浄してください：0.1％のTween（PBST）を含むPBS、PBS、そして最後に脱イオン（DI）水：3つの別々の洗浄のための3分間は、次のソリューションでそれらを置く。実験の種類に応じて（湿式対乾式）、アルゴンガスで十分にチップを乾燥し、インキュベーションを開始するか、フローチャンバー内にチップを置いて、組み立てる。 シェーカーのプレート上にしながら30分間7.4に調整pHを持つエタノールアミンの50 mM溶液にチップを沈めることによって共重合体の表面上の残りのNHS基を無効にします。調製した溶液は、タンパク質で安全に使用できる限り、そのようなヒドロキシルアミンまたはTrisのような一級アミン含有化合物はまた、使用することができます。徹底的にPBS次にDI水を使用して非活性化のソリューションをすすぐ。 オプションのステップ（採用されている表面の化学的性質に応じて）：BSA、カゼイン、の溶液または30分間再水和した牛乳を使用してブロックの表面。ポリマー骨格は、非特異的タンパク質の結合を防ぐために働くように私たちが使用する現在のポリマー表面の化学的性質のために、我々は、この手順を実行しないでください。 3。データ収集とインキュベーション手順：エンドポイントの形式希望するバッファへの関心の対象のソリューションとなります。ここで、それはPBSで抗BSAの適切な濃度（10 ngの/ PBSで抗BSAのmL溶液1-10 mLを加えるEX）のソリューションとなります。また、ネガティブコントロールのインキュベーション用緩衝液の相当額を（対象なし）を持っていることを確認してください。 すべての後に収集したデータを正規化するためのシリコンミラースキャンしてください。 各スポットでの初期の光の高さ（質量）を決定する前に、インキュベーションのステップへIRISシステムを持つ準備されたプローブの配列をスキャンします。これは表面上の質量の変化を適切に分析を可能にする、インキュベーション後、結合のレベル、すなわち。ここで、いくつかのパラメータは、現在のような露出時間などの実験、、視野、繁栄泳動、等のために調整されます。 シェーカーのプレート上で1時間、調製した溶液に浸すのチップ（S）。インキュベーション時間は、フローチャンバーの撹拌、ターゲットの濃度が検出され、輸送特性（リアルタイム検出モードが使用されている場合）、ターゲット – プローブペアの親和性、などのレベルに応じてかなり異なることがあります。 インキュベーション後、ステップ2.5で説明した洗浄手順を繰り返します） IRISシステムを使用して、同じプローブアレイをスキャンし、プレインキュベーションの比較のためのポストインキュベーションの画像を得る。 二次抗体が使用されているサンドイッチアッセイ形式の例については、必要に応じて別のインキュベーションステップのためにこのプロセスを繰り返します。 4。データ解析プロにラボが開発したソフトウェアを使用して、それぞれの虹彩スキャン（強度イメージのシーケンス）のために収集された画像を合わせる光学的厚さ情報を含むプローブアレイのイメージを首領。結合の迅速な定性分析は、（登録）後、プレインキュベーションの画像を減算することによって行うことができます。結合は質量の変化が観察されたそれらのスポットの強度の変化として表示されます。定量分析の場合は、スポットとスポットの環状の外側内の各ピクセルの光学的厚さの情報を平均化し、これらの2つの領域の直接比較を行うことによって、バックグラウンドと比較して各スポットの質量密度を決定する。 5。代表的な結果： 図1は、代表的な抗体アレイをスポットしたレイヤーのSi – SiO 2の IRISの基板の例の回路図を示します。各抗体のアンサンブルは、異なるタンパク質をターゲットと異なるエピトープに対する特異性と複製にスポットする。二つの異なる全ウイルスおよびウイルスタンパク質は、例えばターゲットとして表されます。ネガティブコントロール抗体は、アッセイに依存し、非特異的および/またはウイルス特異的であることができる。 図2は、ヒト血清アルブミンの結合（HSA）特有の斑点HSAとウサギIgG（コントロール）スポットの配列に対する抗体を示しています。ここに見られるように、光のフィッティングと決定した後、プリとポストインキュベーションイメージのために厚さ、結合配列のための差分画像を定性的に結合評価するために作成することができます。定量分析は、500 ng / mLの抗HSAインキュベーションの濃度に対して、それぞれ、HSAおよびウサギIgGのスポットを観察された2.05と0.13ナノメートルの光の高さの変化を意味することが明らかになった。 図3は、タンパク質濃度とdsDNAのオリゴマーの長さに毛皮のタンパク質結合依存のIRISの測定を示しています。上のグラフは、初期固定化オリゴマープローブの高さとポストインキュベーションの毛皮の結合のための絶対的な光学式高さ測定を示しています。毛皮の増加する濃度（50、100、200 nm）はDNAプローブに増加した結合をもたらした。オリゴマーの長さは、またより多くの結合の結果より長い配列を持つ毛皮の結合に影響を与えます。ここで、エラーバーは平均値から一つの標準偏差を表しています。下のプロットは、dsDNAの鎖あたりの結合計算された毛皮のタンパク質二量体を示しています。二量体の結合が著しく非特異的結合の高レベルを示唆する200nMの毛皮のタンパク質濃度で増加した。 図1通常IRISシステムと多重化方式で特定のウイルスやウイルスの成分を検出する実験で使用したサンプルプローブアレイの回路図。 図2斑点のHSAへのヒト血清アルブミン特異的抗体の結合のためのポストインキュベーションの差分画像は、500 ng / mLの濃度でこのラベルフリーシステムで収集。各スポットのための生体材料の質量密度は、スポット内で光学的厚さの情報を平均化してから、バックグラウンドを代表するスポットの周囲に環状の平均でこれを比較することによって決定されます。 図3。オリゴマーの長さ、オリゴマー内のコンセンサス配列の位置、および毛皮のタンパク質濃度に基づいて、既知のコンセンサス配列と斑点のある二本鎖オリゴマーと毛皮のタンパク質相互作用のためのデータバインディングのプロット。各斑点のシーケンス（上部）にバインドされている毛皮のタンパク質の絶対量に関する情報は、オリゴマー（底部）の各タイプにバインドされている毛皮の二量体の数を推定するために使用することができます。